YF®594 TUNEL 细胞凋亡试剂盒(红色荧光) 货号: T6014S/T6014L 规格: 20T/50T

上海金畔生物科技有限公司代理UELANDY荧光染料全系系列产品

YF®594 TUNEL 细胞凋亡试剂盒(红色荧光)

产品货号: T6014S/T6014L

产品规格: 20T/50T

目录价(元):1105/2211

推荐仪器:荧光显微镜(主推)、流式细胞仪

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产品概述:

产品内容

组分

规格

20T 50T

A. TUNEL Equilibration Buffer

2×1 mL

5 mL

B. YF®488/555/594/640/Cy3 TUNEL Reaction Buffer

1 mL

2 × 1.25 mL

C. TdT Enzyme

20 μL

50 μL

D. Proteinase K (2 mg/mL)

40 μL

100 μL

E. DNase I (2 U/μL)

5 μL

13 μL

F. 10 × DNase I Buffer

100 μL

260 μL

储存条件
本产品应置于-20℃储存,组分 B 需避光,避免反复冻融。有效期见外包装。
注:组分 A 和 B 使用时请佩戴口罩、手套,接触皮肤,请立即用大量水冲洗。

产品介绍
细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体 DNA 的降解,这是一个较普遍的现象。这种降解非常特异并有规律,所产生的不同长度的 DNA 片段约为 180 bp-200 bp 的整数倍,表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现特异的梯状 Ladder 图谱,本试剂盒采用 TUNEL 法,应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在凋亡细胞断裂 DNA 的 3´-OH 末端催化掺 YF®594-dUTP。YF®594-dUTP 标记的 DNA 可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪定量。TUNEL 法可以选择性的检测凋亡细胞,而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的 DNA 链断裂的细胞。TUNEL 实验中,TdT 酶催化 dUTP 掺入断裂的 DNA 链的 3´-OH 末端。抗原标记的 dUTP(如地高辛-dUTP、生物素 -dUTP),因为它可以直接进行原位检测,是一种更快速、直接的检测手段。

注意事项
1. 荧光染料均存在淬灭问题,保存和使用过程中请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。
2. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

说明书:

YF®594 TUNEL 细胞凋亡试剂盒(红色荧光) 货号:               T6014S/T6014L  规格:               20T/50T UE-T6014S/T6014L    
MSDS:

MSDS T6014 YF®594 TUNEL Apoptosis Kit(Red fluorescence)
常见问题解答:

为什么出现了一些非特异标记?

1. 有些细胞或组织,比如平滑肌核酸酶或聚合酶活性水平较高,使得DNA全部被切断,易导致假阳性。建议:取出细胞或组织后要立即固定并充分固定,以阻止这些酶的活性,同时设置阴性对照。
2. 内源性过氧化物酶影响,建议:对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织,适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度。
3. 固定液浓度过高或过低,导致组织中心部分固定效果不佳,而使得中心部细胞自溶、DNA链出现不规则断裂,产生假阳性。建议:推荐使用4%多聚甲醛。
4. TdT 酶反应时间过长或Tunel反应过程中反应液发生蒸发或渗漏,细胞或组织表面不能保持湿润。注意控制反应时间,并确保TdT 酶反应液能很好地覆盖样品。
5. 石蜡、脂肪、血液、体液等都较易与染料结合,所以组织切片制作时要保持干净、脱蜡要彻底。
6. 有些试剂或细胞存在自发荧光,选择染料时要避开自发荧光的颜色。

为什么没有染上荧光?
1. 固定不充分。固定液首选4%多聚甲醛,现用现配。不建议使用乙醇,乙醇固定液对组织的渗透力较弱,影响TUNEL标记效率.
2. 细胞膜和核膜的通透不充分,TdT酶未能到达核内。细胞与冰冻切片,可用0.2% Triton X-100溶液通透5-30min,石蜡切片推荐使用蛋白酶K,37℃通透30 min;不同的细胞和组织所需要的通透时间略有不同,时间太长容易脱片,适当调整。
3. 延长标记时间至2h,并适当增加TdT酶及dUTP的用量。
4. 确定实验对象细胞有凋亡。准备一份DNase I处理的阳性对照,验证TdT酶反应是否正确进行。

如何对细胞核进行复染?
可在TUNEL反应结束后对细胞核进行染色。

为什么荧光背景高?
1. 支原体污染:可以使用支原体染色检测试剂盒验证。
2. TdT 酶反应时间过长,可以用试剂盒提供的TdT酶稀释液将TdT酶稀释2-5倍后再按照说明书操作,稀释后的TdT酶仅供当日使用。
3. 处于高速分裂和增殖状态中的细胞,有时也会出现细胞核中的DNA 断裂。建议:在非高增殖期取样检测;
4. 有些试剂或细胞存在自发荧光,选择染料时要避开自发荧光的颜色。
5. DAB 孵育时间过长,减少DAB 染色时间。
6. Biotin-X-dUTP 的非特异性结合,在TdT 酶反应之后,再用含0.1% Triton X-100 和1 mg/ml BSA 的PBS 洗三次。

标记率低?
1. 乙醇、甲醇或甲醛(市面上购买的甲醛大多含有甲醇)固定的样品标记效率较低(因为在固定时染色质未能与蛋白质交联,而在操作中丢失),采用推荐的固定液。
2. 固定时间过长,导致交联程度过高,减少固定时间。
3. 贴壁细胞如果使用药物诱导凋亡,会细胞皱缩,贴壁黏附力降低,导致凋亡细胞容易脱落。建议:在凋亡诱导结束后,可以对多孔板进行1000g离心5min,然后再吸出培养基并用PBS洗涤。如果没有适合的离心机,请注意操作轻缓,防止发生凋亡的细胞在洗涤时被洗去。后续整个操作也需要轻缓。

在蛋白酶K中消化组织样品多久?
大部分组织样品需要充分消化15分钟。最佳的培养时间根据组织类型和厚度而不同。脑组织比其他组织需要更长的蛋白酶处理时间。
 
实验的组织切片应该多厚?
老鼠肠、肾脏、肝脏、心脏和结肠厚度5–20 µm。


使用本产品的文献:

1.OGG1-initiated base excision repair exacerbates oxidative stress-induced parthanatos
Ruoxi Wang, Chunshuang Li, Ping Qiao, Yaoyao XUE, Xu Zheng, Hongyu Chen, Xianlu Zeng,Wenguang Liu, Istvan Boldogh, XUEqing Ba
Cell Death&Disease(2018) DOI: 10.1038/s41419-018-0680-0
应用方向:流式分析

2.VEGF-C/VEGFR-3 axis protects against pressure-overload induced cardiac dysfunction through regulation of lymphangiogenesis
Qiu-Yue Lin, Yun-Long Zhang, Jie Bai, Jin-Qiu Liu, Hui-Hua Li
Clin Transl Med

参考文献
1.Apoptosis caused by Hsp90 inhibitor geldanamycin in Leishmania donovani during promastigote-to-amastigote transformation stage
应用方向:细胞凋亡染色&流式分析

2.Notch gain of function in mouse periocular mesenchyme downregulates FoxL2 and impairs eyelid levator muscle formation, leading to congenital blepharophimosis
应用方向:切片染色

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