组织透明化试剂Q&A ver1.0
Tissue clearing reagent Q&A ver1.0
Q：组织透明化的原则
Ａ：组织透明化通常是按下面的步骤进行的：
Ａ（a）固定 （b）透化 （c）脱色 （d）折射率匹配
Q：组织透明化的优势
Ａ：目前大多数可用的透明化技术，都是通过编码荧光报告蛋白或者用荧光标记抗体进行后标记，从而可视化组织中特定的蛋白。组织透明化成为
Ａ：了具有单细胞分辨率的组织3D成像中重要的一环。
Q：透明化技术的比较
Ａ：下面是水性的透明化技术。
Ａ：SeeDB（基于果糖的方法）在一些应用中有一定优势。因为SeeDB不含去垢剂，所以对于透明化 DiI（细胞膜红色荧光探针，一种神经示踪剂）标记的样品和使用光电关联显微镜（CLEM）的情况下，SeeDB 有着一定优势。另外 SeeDB 会产生自体荧光，有时候会对辨认未标记的神经元结构（如神经毡）起着一定帮助。
Ａ：SeeDB2 是为使用高 NA 物镜的高分辨率成像而优化的技术；因此，当处理较大的组织时，CLARITY 或者 CUBIC 会是更好的选择。
Q：切片厚度的最大值和最小值？
Ａ：您应该根据您的物镜的 WD（工作距离）来决定切片的厚度。我们建议切片的厚度不要超过 3 mm。对于十分薄且脆弱的样品，我们建议使用
琼脂糖包埋。使用 CUBIC，可以让全器官、全身透明化和使用 LSFM 的快速 3D 成像具有可重复性。
Q：试剂盒成分
Ａ：具体如下：
Ａ：1. SCALEVIEW-S试剂盒（299-79001）适用于20份1-2 mm的切片样品
Ａ：Ａ：1） SCALEVIEW-S0——100 mL
Ａ：Ａ：2） SCALEVIEW-S1——100 mL
Ａ：Ａ：3） SCALEVIEW-S2——100 mL
Ａ：Ａ：4） SCALEVIEW-S3——100 mL
Ａ：Ａ：5） SCALEVIEW-S4——100 mL
Ａ：Ａ：6） SCALEVIEW-SMT——100 mL
Ａ：2. SCALEVIEW-S试剂盒（290-80801）适用于20-30份1-2 mm的切片样品。
Ａ：Ａ：1） SCaleCUBIC-1 Solution——250 mL
Ａ：Ａ：2） SCaleCUBIC-2 Solution——250 mL
Ａ：Ａ：3） Mounting Solution 1——40 mL
Ａ：Ａ：4） Mounting Solution 2——40 mL
Ａ：3. SeeDB试剂盒（299-79901）适用于20-30份1-2 mm的切片样品。
Ａ：Ａ：1） SeeDB：20w/v% Fructose Solution——50 mL
Ａ：Ａ：2） SeeDB：40w/v% Fructose Solution——50 mL
Ａ：Ａ：3） SeeDB：60w/v% Fructose Solution——50 mL
Ａ：Ａ：4） SeeDB：80w/v% Fructose Solution——50 mL
Ａ：Ａ：5） SeeDB：100w/v% Fructose Solution——50 mL
Ａ：Ａ：6） SeeDB——50 mL
Ａ：4. SeeDB2试剂盒（294-80701）适用于20-30份1-2 mm的切片样品。
Ａ：Ａ：1） Saponin（皂角苷）——5 g
Ａ：Ａ：2） SeeDB2G solution——50 mL
Ａ：Ａ：3） SeeDB2S solution——50 mL
Ａ：Ａ：4） PBS——50 mL
Q：样品的保存
Ａ：SCALEVIEW-S处理的样品应在室温下保存2至3周。您可以在2至3周内观察SCALEVIEW-S透明化的样品中的荧光信号。
Ａ：CUBIC处理的样品应在室温下保存1周。您可以在1周内观察CUBIC透明化的样品中的荧光信号。
Ａ：SeeDB2G处理的样品应在冰箱中保存1年，而SeeDB2S处理的样品则可在室温下保存1年。您可以在1年内观察SeeDB透明化的样品中的
荧光信号。
Q：抗体的荧光标记
Ａ：应在进行透明化前就进行抗体的荧光标记。
Q：适用于SCALEVIEW-S的显微镜
Ａ：SD-OSR（Olympus）
Ａ：FV-OSR（Olympus）
Q：适用于CUBIC的显微镜
Ａ：SD-OSR（Olympus）
Ａ：FV-OSR（Olympus）
Ａ：Zeiss Lightsheet Z.1（Carl Zeiss）
Q：适用于SeeDB2的显微镜
Ａ：Confocal（最好使用高NA的油浸镜头）
Ａ：STED（Leica Microsystems）
Ａ：SR-SIM（Carl Zeiss）
Ａ：SD-OSR（Olympus）
Ａ：FV-OSR（Olympus）
Ａ：Airyscan（Carl Zeiss）
Ａ：HyVolution（Leica Microsystems）
Ａ：Two-photon（最好使用复合浸没镜头）
Ａ：Confocal（最好使用高NA的甘油浸镜头）
Ａ：Light-sheet DLS（Leica，最好使用定制镜面的设备）
Q：重构
Ａ：对于定量用途，我们建议使用Neurolucida系统（MBF）。我们同样测试了VAST Lite用于成像用途时的表现。重构时也可以使用开源软件。
例如，Vaa3d可以处理大量的拼接图像的数据。
Q：物镜推荐
Q：其他物种？其他器官？
Ａ：对于昆虫样品和鱼类样品，建议选择CUBIC。
Ａ：昆虫相关文献：Ohuma.et al.: Fish Pathology, 52(2), 96(2017).
Ａ：鱼类相关文献：Konno and S.Okazaki .: Zoological Letters, 4:13(2018).
对于多细胞球状体，选择SCALEVIEW-S会更好。
https://www.nature.com/articles/s41598-018-29169-0
SeeDB
