在基因治疗中广泛应用的逆转录病毒载体存在的主要问题，是无法高效转导非分裂期细胞，而腺病毒载体虽然能转导非分裂期细胞，但在体内不能实现目的基因稳定的长期表达，且反复应用容易引起免疫反应。慢病毒载体不但可以感染非分裂期细胞，还具有容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等优点，在基因治疗中具有广泛的应用前景。

人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)改造的慢病毒载体(Lentiviral vector)既可感染分裂细胞，也可感染非分裂细胞，如神经细胞、造血干细胞、肝细胞等，还具有整合到宿主细胞基因组、稳定长效转染、感染效率高等优点，是细胞基因功能研究和基因治疗中不可多得的优良载体。目前对于慢病毒的滴度滴定大部分通过检测腺病毒内壳蛋白p24的表达来完成。而在一些商用的腺病毒载体中，由于加入了GFP标记蛋白，因此也可以通过流式细胞仪检测GFP蛋白表达水平来分析病毒滴度，病毒滴度为表达GFP的细胞数乘以相应稀释倍数。另外，还可以通过TaqManPCR检测细胞中病毒拷贝数的方法检测滴度。

上海金畔生物科技有限公司针对慢病毒定量为您推荐美国细胞生物学专业产品制造商Cell BioLabs的QuickTiter™ Lentivirus Rapid Quantitation Kit。该试剂盒较p24蛋白表达以及GFP蛋白检测更简介方便，且成本更低。Cell BioLabs慢病毒快速定量试剂盒的工作原理如右图所示，首先使用核酸酶将病毒悬液内的核酸分子降解，然后用特异性的慢病毒捕获珠子结合慢病毒，从而分离出蛋白核酸复合物，洗脱下慢病毒后进一步降解，然后标记其病毒核酸，通过480/520 nm滤镜荧光仪下读取数据，对照慢病毒RNA标准曲线得出慢病毒含量。

Cell BioLabs慢病毒快速定量试剂盒内包括溶液A、溶液B、溶液C、慢病毒捕获液、Dye染料以及慢病毒RNA标准物。该试剂盒能直接用于慢病毒悬液，定量步骤快捷，可以在45-60min内获得数据。检测灵敏，可以从100ul慢病毒上清中检测出10¹⁰VP/ml的慢病毒，足够慢病毒实验中的中、高滴度需求。

Cell BioLabs为您提供全套的慢病毒技术解决方案，ViraSafe腺病毒表达系统有多种样式供您选择；多种慢病毒滴度检测和定量试剂为您提供快捷和准确的慢病毒检测方案；ViraBind™慢病毒浓缩和纯化试剂盒采用了专利技术能让你获得更高滴度和纯度的慢病毒，解决了慢病毒低滴度的软肋；Cell BioLabs还有转为慢病毒载体用的293LTV细胞及慢病毒高效转染试剂供您选择，如果您对慢病毒产品感兴趣，请致电021-50837765到上海金畔生物科技有限公司垂询慢病毒相关的实验解决方案，或索取最新的Cell BioLabs产品资料。

不论是细胞治疗还是基因治疗都离不开病毒载体。目前使用最多的病毒载体类型包括：腺相关病毒（AAV）、慢病毒（Lv）、逆转录病毒（Rv）和腺病毒（Adv）等，这些常用病毒载体特性如下图所示：

因此在选择病毒载体时，除了要考虑载体自身特征之外，如何包装并获取高滴度高活性的病毒载体对后续实验至关重要，针对病毒载体制备5大环节，小美为您推荐如下解决方案↓
（图片2）

1. 病毒载体包装质粒系统
上海金畔生物科技有限公司的美国Cell Biolabs公司推出的病毒包装系统可满足多种重组病毒包装需求，包括四大类型病毒包装质粒AAV Helper Free System、ViraSafe™ Lentivirus Expression Complete Systems、Platinum Retroviral Expression Systems以及RAPAd® Adenoviral Expression Systems等。更多病毒包装质粒系统介绍请点这里。

2. 病毒包装
A. 病毒包装专用转染试剂
上海金畔生物科技有限公司的美国Mirus公司新推出的病毒包装专用转染试剂TransIT®-VirusGEN™与TransIT®-Lenti系列，专门针对AAV和Lentivirus设计，相比传统转染方法能获得更高的转染效率和病毒滴度，无动物源成分且兼容多种病毒包装系统及不同细胞系类型。

B. Lv/Rv包装效率增强剂Lentivirus/Retrovirus 10X Titer-Up
上海金畔生物科技有限公司代理的101Bio品牌Lentivirus/Retrovirus 10X Titer-Up用于重组慢病毒或逆转录病毒包装过程，可促进病毒基因组转录和RNA稳定，使转染效率提高10倍左右。

C. AAV/Adv病毒释放液Virus-High® AAV/ADV Release Solution
上海金畔生物科技有限公司代理的101Bio品牌Virus-High® AAV/ADV Release Solution是一款无需反复冻融，即可从细胞中快速高效收获AAV/Adv病毒以及其他非分泌型无囊膜病毒的试剂。

3. 高效快速病毒浓缩试剂与纯化试剂盒
上海金畔生物科技有限公司独家代理的美国Cali-bio和Cell Biolabs品牌专门针对病毒载体设计的高效重组病毒浓缩纯化试剂（盒），在获得重组病毒高回收率的同时大大简化操作流程，无需超速离心设备，是中小规模样本纯化的首选方案。

4. 病毒滴度检测试剂盒
精确测定重组病毒滴度是提高下游实验可控性，重复性和准确性的前提，上海金畔生物科技有限公司代理的Cell Biolabs品牌针对不同病毒载体的特性分别设计的了多种滴度测定试剂盒，并且兼容了高效和精确的测定方法。

5. 病毒感染增强试剂
上海金畔生物科技有限公司代理的Cell Biolabs品牌还针对不同病毒载体研发了专用促病毒感染试剂，能显著提高病毒对靶细胞的感染，进而提高基因表达效率。

如果您对上述方案感兴趣，欢迎随时登录上海金畔网站www.jinpanbio.cn查询相关产品或拨打上海金畔生物科技有限公司全国服务热线021-50837765，小美期待您的垂询。

病毒载体技术的进步提高了基因和细胞治疗的安全性和有效性，全球已有多种基因和细胞治疗药物被监管机构批准上市。目前大多数基因/细胞治疗方法都是利用病毒载体来实现的，其中最常用的两种病毒载体——腺相关病毒（AAV）载体常被用于基因治疗，而慢病毒（LV）载体则常被用于基因修饰的细胞治疗。病毒载体通常是将2-4个质粒共转入HEK293细胞生产出的，而转染试剂是病毒载体生产的关键要素之一，对转染效率和功能效价有显著影响。第一代非病毒转染方法依靠简单的线性聚合物，如聚乙烯亚胺(PEI)或脂质体将DNA转入到细胞内，但其性能并不能完全满足病毒载体的大规模生产需求。虽然人工合成转染试剂在过去30年里取得了巨大的进步，但仍然难以逾越大自然在数十亿年进化出的依靠病毒传递基因的效率。因此，优化非病毒转染性能的最佳方法是尽可能模仿出病毒转运DNA的自然机制的试剂。

上海金畔生物科技有限公司代理的Mirus转染试剂就是利用自然基因传递机制作为其化合物库的设计灵感，从中筛选出适合病毒生产的混合配方，将转染试剂与核酸的静电相互作用、细胞吸附与内吞、胞内释放、基因表达效率和降低细胞毒性等几乎所有影响转染成功率的因素全部考虑在内。通过不懈的努力，Mirus开发出了一种全新的仿生转染技术——TransIT-VirusGEN系列转染试剂，它不仅仅是基于PEI或脂质体，而是采用多组分脂质聚合物纳米复合物（LPNC），能够高效地结合和包裹DNA，将其带入悬浮或贴壁的HEK293细胞中，然后将其从细胞核内释放，以便同时满足2-4个不同的质粒的表达，这种全新的转染试剂比单独使用PEI及其衍生聚合物或脂质体的转染效率和完整病毒生产效率都有显著提高。同时，Mirus还研发出了一种完全合成的（无动物源）转染增强剂（Enhancer），与TransIT-VirusGEN转染试剂搭配使用时，可以进一步提高病毒滴度。另外，为了满足病毒载体从研发到大规模生产不同阶段的需求，Mirus分别推出了R&D、SELECT和GMP三种级别的TransIT-VirusGEN转染系列产品，以适应不同阶段病毒载体的生产规模、效率以及法规要求。

实验表明，Mirus基于LPNC的转染试剂可以在不同的细胞培养平台（贴壁和悬浮）、生物反应器和培养基类型中提高病毒产量和功能性病毒滴度。与业内其他金标准相比，在不使用增强剂的情况下，病毒滴度至少可提高2-4倍。而在加入增强剂之后，在合适的培养条件下，病毒产量甚至能够提高10倍以上！（结果见下图1-5）

图1. 基于脂质聚合物纳米复合物（LPNC）和聚乙烯亚胺（PEI）配方的转染试剂用于腺相关病毒(AAV)和慢病毒(LV)载体生产的性能对比。分别用基于LNPC的TransIT-VirusGEN试剂（不含增强剂与含增强剂）、25kda PEI和基于PEI技术的竞争品牌A3转染试剂产生AAV（左）和LV（右）。以LPNC为基础的TransIT-VirusGEN转染试剂比以PEI为基础的转染试剂的病毒颗粒表达量高3-5倍。当TransIT-VirusGEN和增强剂同时使用时，比单独使用TransIT-VirusGEN大约提升了一倍。转染试剂 : DNA的比值为体积 : 质量。

图2. TransIT-VirusGEN转染试剂在不同细胞培养基中的表现。使用Thermo Fisher Scientific公司的病毒生产细胞进行转染，该细胞适应四种不同的培养基配方，分别来自Thermo Fisher公司的LV-MAX培养基、Expi293表达培养基、FreeStyle F17表达培养基和来自Irvine Scientific公司的BalanCD HEK293培养基。后一种培养基的AAV总效价较高，但在所有使用的培养基中，无论是否添加增强剂，TransIT-VirusGEN转染试剂均表现优异。DNA与转染试剂配比为2μg DNA ：3μl转染试剂，转染细胞密度为2.0×106个/ml。生产LV也获得了类似的结果(数据未显示)。

图3. 分别在四种不同的转染条件和两个不同的收获时间，测定TransIT-VirusGEN转染试剂和PEI为基础的转染试剂A3的物理滴度和功能滴度。利用Expi293F细胞生产AAV2-GFP。转染48小时和72小时后收获的病毒分别测定功能滴度TU/mL（左）和物理滴度GC/mL（右）。结果显示用TransIT-VirusGEN转染试剂和增强剂转染收获的病毒效价最高。此外，TransIT-VirusGEN转染试剂比PEI为基础的转染试剂的表达更快。这些结果表明，对于病毒滴度的评估，功能滴度可能是一个更可靠的指标。因此，建议测试几个不同的收获时间点来确定最佳方案。

图4. 每种培养体系都应优化转染时的细胞融合度和接种密度。用DMSO+10%胎牛血清培养贴壁的HEK293t/17细胞生产慢病毒（1μg DNA/mL）。试剂盒包括TransIT-VirusGEN转染试剂、VirusGEN LV复合物形成溶液和VirusGEN LV增强剂。

图5. 在Expi293表达培养基中培养Expi293F细胞，使用VirusGEN AAV转染试剂盒，内含TransIT-VirusGEN转染试剂、VirusGEN AAV复合物形成溶液和VirusGEN AAV增强剂，在悬浮细胞培养中生产AAV。分别用2:1（左）和3:1（右）两种比例来确定理想的转染试剂和DNA配比（体积：质量）。每种转染体系都应对转染试剂: DNA配比及每毫升细胞所需的总DNA量进行优化。

TransIT-VirusGEN转染系列产品信息

美国Mirus公司成立于1995年，是世界上很早开发高效、低毒转染试剂的公司之一，同时也是目前该类试剂主要的供应商之一。Mirus被公认为转染试剂开发的领跑者，其许多杰出成果获得世界公认与广大用户的好评。

上海金畔生物科技有限公司是Mirus中国区代理，始终秉承着专业、严谨的态度为客户提供优质的产品与服务。如果您对上述产品感兴趣，欢迎致电上海金畔客服热线021-50837765或登录网站www.jinpanbio.cn了解更多产品信息或申请试用。

引用文献：

Addressing Critical Issues in Cell & Gene Therapy, Snow, J.

（https://www.mirusbio.com/assets/technical-documents/addressing-critical-issues-in-cell-gene-therapy.pdf）