在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中另外用内参抗体检测内参蛋白的表达。由于内参蛋白在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。就一般的蛋白检测来说，Actin抗体、Tubulin抗体等就可以了，而针对于核蛋白的定量，特别是样本蛋白就是核蛋白时，选择恰当的核蛋白内参则更能体现内部参照的价值。

当实验样品中只是核蛋白，而不是细胞总蛋白提取液时，可以用组蛋白H（Histone H)，或者核纤层蛋白(nuclear lamina protein)等为核内参抗体。除了这些，其它常见的核蛋白内参还有K70, K80, Lamin A和B，在一些文献报道中，Erk2、TATA binding protein（TBP）以及c-Jun、c-Fos等都有使用。但是需要注意的问题是核蛋白内参的选择需要考虑实际的试验环境，比如在涉及细胞增殖相关试验中，c-Jun由于自身表达变化就不适合做内参；而在凋亡实验时，TBP、Lamin等也不适合作为内参。反之，组蛋白Histone H2A.X及Histone H3.1等由于是染色体的组成型表达组分，表达比较稳定，经常被作为最广泛的核内参使用。

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（图片来源于Hampton Research公司）

因为蛋白质具有离子的性质，理论上蛋白质在合适的条件下是可以结晶的，蛋白质又具有离子不具备的特性，比如蛋白质种类繁多、成分复杂、分子量大等，不像NaCI那样，去掉水就自动结晶，剧烈的条件改变会引起蛋白的变性，使蛋白失去稳定结构而不再可能结晶。

如果想要蛋白质结晶，我们首先需要对目标蛋白有足够的了解，因为影响蛋白质结晶的因素非常多，包括蛋白质的缓冲体系、是否有翻译后修饰、是否有二硫键或游离半胱氨酸、是否有蛋白酶抑制剂存在、蛋白质适合的pH值范围、蛋白质是否为多聚体以及是否为跨膜蛋白等，这些因素都会影响蛋白质结晶的成功与否。

因此，大部分科研工作者会筛选非常多的条件来寻找最优结晶条件，这时我们就需要筛选试剂来辅助蛋白结晶工作。美国Hampton Research公司有非常广泛的产品组合，包括结晶初步筛选、结晶优化筛选、定制单组分结晶试剂和结晶生长优化试剂等。除了筛选试剂外，美国Hampton Research公司还有各种结晶板、配套工具、低温晶体学相关产品和蛋白结晶相关书籍等，为广大蛋白结晶领域的科研工作者提供了方便。

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4. Hydrogen Ion Buffers for Biological Research. Ferguson, W. J.,Braunschweiger, K. I., Braunschweiger, W. R., Smith, J. R.; McCor­mick, J. J., Wasmann, C. C., Jarvis, N. P., Bell, D. H.; Good, N. E. (1980). Anal. Biochem. 104 (2): 300–310.
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17. 蛋白质晶体结构解析原理与技术，北京大学出版社，苏纪勇，姚圆 著

阿尔兹海默病的发生，与家族遗传、疾病史和生活方式等因素有关,大约25%的阿尔兹海默病病例是由于家族遗传原因导致的。目前也发现多种易感基因增加了疾病发展的风险,例如APOE基因具有三种等位变异，即e2，e3和e4，它们编码不同的蛋白质异构体，APOE e4等位基因的杂合子或纯合子的存在增加了发病的风险。其它与早发性阿尔兹海默病相关的基因包括APP，PSEN1和PSEN2。其它增加迟发性阿尔兹海默病发病风险的基因有ABCA7,AKAP9, BIN1, CASS4, CD2AP, CD33, CLU, EPHA1, FERMT2, HLA-DRB5/DRB1, INPP5D, MEF2C, MS4A6A/MS4A4E, PICALM, PLD3, PTK2B, SORL1, TREM2和UNC5C。

阿尔兹海默病的发病机制被归因于大脑皮层和边缘神经元中β淀粉样蛋白和细胞内高磷酸化微管相关蛋白聚集物（Tau聚集物）在细胞外的积累[1]。淀粉样蛋白积累发生于γ分泌酶和BACE1对淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的改变切割，以产生不溶性Aβ纤维。这些原纤维聚集，进入突触间隙，干扰突触信号，并聚合成斑块。聚合激活激酶，导致Tau蛋白的过度磷酸化和聚合成神经纤维缠结。斑块和缠结的积累触发了小胶质细胞的激活和局部炎症反应[2]。神经纤维缠结(NFTs)是微管相关-protein (Tau)过度磷酸化的结果。蛋白与微管蛋白共同组装形成成熟的微管。当Aβ纤维在细胞微环境中积累时，释放的激酶会使-protein过度磷酸化，导致其寡聚并聚集成NFTs。这些神经元胞质内高度不溶性的NFTs积累导致神经元之间通讯的丢失，最终导致细胞凋亡。其他激酶也参与蛋白的磷酸化或APP的加工，包括GSK3β，CDK5，蛋白激酶C，蛋白激酶A，ERK2，caspase 3和caspase 9。此外，参与蛋白过磷酸化的其他激酶包括MAPK，ERK1，MEK，MARK，JNKs，p38和PKA。斑块形成过程中的小胶质细胞浸润也被证明会加剧阿尔兹海默病的发病。细胞外和细胞内的斑块和NFTs引起毒性和小胶质细胞浸润以及促炎细胞因子和趋化因子的释放，触发斑块区域的免疫反应。其他与阿尔兹海默病相关的基因包括早老素(PSEN1和PSEN2)，它们属于γ-分泌酶家族，其突变与早发性阿尔兹海默病相关。除此之外，G蛋白偶联受体（GPCRs）家族已被确定参与中枢神经系统疾病和阿尔兹海默病[3]。GPCRs是一个膜蛋白超家族，包括5个不同的家族成员，即rhodopsin (a家族)、secretin (B家族)、glutamate (C家族)、adhesion(粘连)和Frizzled/Taste2。GPCRs参与了阿尔兹海默病的发病机制，并被证明与BACE1和γ分泌酶结合，这两种酶都参与了APP的水解处理[4]。

尽管目前还没有药物可以逆转阿尔兹海默病，但许多治疗药物被用来对抗这种疾病中出现的神经递质短缺和失衡。例如：乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChEIs)，如多奈哌齐、加兰他敏和利瓦斯汀，可增加突触上乙酰胆碱的可利用性。临床试验中的其他药物如γ-分泌酶抑制剂，BACE抑制剂，α-分泌酶调节剂，淀粉样蛋白聚集抑制剂等针对细胞外间隙和神经元中异常蛋白(淀粉样蛋白和tau蛋白)的积累，以防止它们的错误折叠。激酶抑制剂也是正在研究的治疗靶点，以防止tau蛋白的过度磷酸化或聚集。其他正在进行临床试验的治疗方法包括抗炎药物和补体阻滞剂，促进神经再生的生长因子，以及干细胞治疗。

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[1] Tiwari S et al. Alzheimer’s disease: pathogenesis, diagnostics, and therapeutics. (2019) Int J Nanomedicine. 14:5541-5554. https://doi.org:10.2147/IJN.S200490

[2]Crews, L Masliah E. Molecular mechanisms of neurodegeneration in Alzheimer’s disease. (2010). Hum Mol Genet. 19(R1):R12-R20. https://doi:10.1093/hmg/ddq160

[3]Xu, Y et al. (2020). GPR68 deletion impairs hippocampal long-term potentiation and passive avoidance behavior. Molecular Brain. 13:132. https://doi.org/10.1186/s13041-020-00672-8

[4] Zhao, J et al. (2016). G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) in Alzheimer’s Disease: A Focus on BACE1 Related GPCRs. Frontiers in Aging Neuroscience Vol8, Article 58:1-15. https://doi.org/10.3389/fnagi.2016.00058