在新的样品类型中，如何验证样品的稀释和实现线性

◆免疫分析样品的验证实验——什么是基质干扰？

酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种基于微孔板的技术，常用于检测和定量各种生物样品中人们所感兴趣的低丰度待测分析物。 该技术取决于两个要素：（1）通过由酶和标记二抗结合所产生的比色产物的显影来高度准确地测定抗体-抗原间的相互作用（2）基于上述相同的相互作用，以标准参考重组蛋白制作标准曲线， 然后再与之前的结果准确比对，从而得出生物样品中待测物的浓度。

在市售的ELISA试剂盒中，准确测量分析物的关键，是对您的独特样品和（或）未经试剂盒制造商验证的样品进行测试。由于不同的抗体-分析物有不同的结合特征，且目标分析物中样品基质的背景中存在固有内源物质的差异，可能会使得这些样品难以用试剂盒中的抗体获得稳健的检测和定量效果。这称为样品的基质干扰。这些干扰物质是结构相似但化学性质有差异的化合物，它会与靶向目标分析物发生抗体交叉反应。受到这种干扰时，样品基质中内源性干扰物质或外源性污染物会导致光学密度（OD值）错误地增加或减少，不能反映分析物浓度真实水平。会产生基质干扰的样品包括一些富含蛋白质的样品，或一些具有潜在基质干扰的样品， 如尿液、细胞裂解液和血液成分（血清和血浆）。

除了样品固有的内源性物质和由于人为错误产生的外源性污染物之外，使用者可能还需要评估测定用的稀释缓冲液与潜在的干扰组分之间的相容性。干扰组分可以是pH依赖性的、去垢型的或有机溶剂型的，缓冲溶液盐的组成和浓度会决定缓冲液的相容性。有时候可能需要更换缓冲液来排除干扰，以便能检测样品中分析物的真实浓度。另一方面，当分析物的水平显著升高到超过测定的定量限（LOQ）时，优化样品的稀释度成为克服这种干扰的一种策略。为了确保样品能准确地检测和定量，并减轻样品基质效应，终端用户可能需要考虑通过加标-回收以及稀释线性实验来进行样品检验。

◆加标-回收实验

加标和回收实验的主要目标，是确定分析物的检测是否受到使用者制备标准曲线时所用的测定稀释剂/缓冲液与样品基质之间的差异的影响。样品基质可以是纯的（未稀释的）生物样品或以测定稀释剂稀释的生物样品。这是通过将已知量的重组蛋白质标准品加入天然测试样品基质中（加标），并观察其相对于向测定稀释剂中加入相同已知量的重组蛋白质标准品的响应（回收）来实现的。响应（终浓度）可以根据添加的重组蛋白质标准物的量从标准曲线和OD值来计算得出。在运行两组响应并从标准曲线计算出浓度后，终端用户可以计算出回收百分比，以确定观察到的加标样品值与观察到的未加标样品值相对于实际已知量的百分比偏差，从而确定稀释剂和样品基质的兼容性。作为使用者，他们希望在样品基质和测定稀释剂/缓冲液中对给定的目标分析物实现相同的响应。换句话说，完全相容的样品基质应该获得100％的回收率，因为加标后所观察到的回收率在稀释剂测定时和样品基质测定时所获得的回收率是应该相同的。回收率最大可能会偏离20％。如果回收的值与预期的量有显著出入（根据加入已知的量来计算得出），那么与100％回收率对比所发生的偏差可能能够表明稀释剂与样品基质的不相容性/差异程度，在这种情况下必须进行调整来尽量减少偏差。在样品回收率非常差的情况下， 建议使用其他不同的、其组成与样品基质更加接近的分析稀释剂。

◆稀释线性实验

如样品在系列稀释下未呈现出线性，则表明在给定稀释度下，基质组分干扰了对目标分析物的准确检测。因此，使用者将样品稀释至观察不到干扰时，有必要校正稀释因子。进行稀释线性实验是为了证明，加标浓度高于定量上限的样品可稀释至工作标曲范围内的浓度，并仍可以产生准确可靠的结果。钩状效应所带来的不良线性，也可通过实现稀释线性来减轻。当分析物的浓度开始超过抗体的量时，会产生钩状效应。这时候，随着分析物浓度开始远远超出可用的抗体的量时，剂量反应曲线的平台在进一步增长时的斜率会开始变负，说明出现了潜在的基质干扰且的分析物浓度定量的准确性开始降低。使用合适的、精选的稀释剂在分析范围内来对样品进行系列梯度稀释。当稀释线性出现时，连续的稀释点OD值会出现线性变化，或者每个稀释点乘以稀释倍数后，将计算得到大致相同的样品浓度。例如，如果使用者进行两倍连续稀释，则每个点之间的OD值大致应该有两倍的差异。对于已知最小所需稀释度（MRD）的已测样品，在理论上该值可作为起始点，然后通过一系列的稀释来确定该起始点是否合适。如果样品尚未经过检测，则可能需要通过以一个更大范围的稀释度的滴定来确定MRD， 从而实现线性。稀释线性能保证测试的高度准确性并且表明该测试在不同稀释度下具有灵活性。

进行稀释线性实验也可以通过制备几种具有低浓度分析物的样品的稀释液，将已知量的相同分析物掺入每一个稀释液中，然后通过比较未加标和（或）未稀释样品的所观察到的值和预期的值，从而来测试和评估测定回收率。在稀释后，拥有理想线性的样品，所被观察到的样品浓度相对于其终浓度来说不应该出现变化。当样品回收率可在预期值的80％至120％范围之内，即可实现线性。考虑到稀释数据在测定范围内的低端会有统计学上的限制，因此应该避免有低于测定中定量限两倍的值。

◆总结

Enzo Life Sciences有着各式各样的ELISA试剂盒，旨在检测各种生物标志物，有着多种样品基质可供测试。我们的试剂盒广受欢迎，而Enzo Life Sciences在开发和优化商业免疫检测方面有着数十年的经验，可以满足科学界不断变化的需求。我们提供广泛的免疫测定试剂盒，用于监测野生动物的压力，生殖，健康，福利和生存。我们较受欢迎的用于量化17β-雌二醇，黄体酮，睾酮，皮质醇和皮质酮的ELISA用于许多出版物和协议，已被全世界的动物园，水族馆和保护科学家所使用。我们很乐意为您的研究需求提供简单而实用的技巧和指导。如需订购请联系客服。

强干扰样品中的内毒素检测方法

　　注射类药物产品的内毒素污染可导致严重后果，包括发烧、败血症和败血性休克。因此，内毒素检测已成为注射类处方药、医疗器械生产和质量控制的必要检测。

　　鲎试剂（LAL) 检测是内毒素评估的最佳成熟检测方式¹⁾。其主要采用鲎的变形细胞提取物与待检测内毒素污染样品进行孵育，如果分析样品中存在内毒素，则会形成凝块。最传统的LAL检测方法是定性的凝胶法。随后，开发了定量LAL检测方法，包括显色法和浊度法。

　　LAL检测的准确性和可靠性已得到证实。然而，被测产品、检测剂成分、环境甚至容器相关的各种因素可能会导致测试难以进行或出现误导性结果，其中包括样品干扰或内毒素掩蔽剂^2-4)。可能干扰LAL检测的因素包括化学抑制剂（如乙二胺四乙酸，EDTA）；变性剂（如浓酸、碱、无机盐或有机溶剂）；碱化乙醇分子；超出最佳范围的pH值；内毒素掩蔽剂（赋形剂、表面活性剂、螯合剂或 N-二甲基氧化胺等物质）；或内毒素被容器表面吸收¹⁾。对于医疗器械，抗凝涂层、重金属含量或微粒的存在可能会干扰测试结果²⁾。对于使用显色法检测的样品，与 鲎试剂接触时，检测混合物中的特定颜色也会干扰测试结果¹⁾。对于用浊度法检测的样品，样品中的浑浊或悬浮也可能导致干扰¹⁾。

　　以下整理了内毒素检测中不同的抗干扰方法，以降低样品干扰或内毒素掩蔽的因素给实验结果带来的影响：

◆适当稀释样品

　　如果在LAL检测过程中没有干扰或增强效应，可以对未稀释的样品进行检测。如果样品存在干扰LAL检测的成分，则应稀释样品以减少干扰或增强。建议确定最大稀释倍数，保证减少干扰效应但仍可进行内毒素测定²⁾。

◆消化、使用缓冲液、过滤或离心

　　这些都是降低医疗设备检测干扰的潜在处理方法²⁾。具体选用哪种操作应取决于对实验干扰因素的评估和对检测条件的验证。

◆保持最佳pH范围

　　LAL检测的最佳 pH 范围在6.0–8.0范围内，检测条件应保持在此范围内以确保结果一致。

◆保证样品的均匀性

　　悬浮样品可能会导致干扰问题。因此，应尽量保证样品的均匀性。在这种情况下，不建议混合来自制造过程不同阶段的样品，因为难以确保不同阶段产品可以混合均匀²⁾。

◆调整混合样本的最大有效稀释倍数（MVD）

　　某些情况下，小体积单位的成品药可能会合并成复合样品，再进行LAL检测。在这种情况下，应通过将单个样品计算的的MVD除以合并样本的总数，按比例将MVD调整为较低值²⁾。

◆使用在LAL 检测经过充分验证的试剂和样品容器

　　由于鲎试剂和样品容器的成分也可能对检测结果产生负面影响⁴⁾，因此建议使用经充分验证的鲎检测和样品容器。

◆相关产品

内毒素特异性鲎试剂PYROSTAR™ ES-F 系列（凝胶法/动态浊度法）

内毒素特异性鲎试剂Limulus Color KY（动态显色法）

◆参考文献

1) Wheeler, A. Comparing endotoxin detection methods. Pharmaceutical Technology 2017;41:58–62.

2) FDA. Guidance for industry: pyrogen and endotoxins testing: questions and answers. June 2012.

3) Reich J, Lang P, Grallert H, Motschmann H. Masking of endotoxin in surfactant samples: Effects on Limulus-based detection systems. 

    Biologicals. 2016;44(5):417-22. doi: 10.1016/j.biologicals.2016.04.012.

4) Bech Ørving R, Carpenter B, Roth S, Reich J, Kallipolitis B, Sonne-Hansen J. Bacterial Endotoxin Testing-Fast Endotoxin Masking Kinetics

    in the Presence of Lauryldimethylamine Oxide. Microorganisms. 2020;8(11):1728. doi: 10.3390/microorganisms8111728. 

梅雨季节样品易潮？试试三博特防潮箱

梅雨，是在中国长江中下游地区等地，每年6、7月份出现的持续天阴有雨的气候现象

入梅后气温和湿度也会较高。对存放湿度有要求的实验试剂（如遇水易变质的试剂、易吸潮的试剂）、精密仪器配件，若直接保存在高湿度的环境下，会对其造成一定影响。

为此，日本三博特可提供能自动维持相对湿度在30-40% RH的防潮箱，助您解决在梅雨季节下试剂、样本的保存问题。

该产品为全自动防潮箱，无需更换硅胶。常温下柜内湿度可保持在30~40% RH，适合长时间保存物品。

这款防潮箱的柜身玻璃为茶色玻璃，可防止保管物品劣化·褪色。

*箱内湿度可参考前门上的湿度计（使用金属弹簧式湿度计，震动等因素会造成误差，数值仅供参考）。

◆除湿原理

防潮箱可定时循环启动，进行吸湿及烘干干燥剂（自动硅胶再生功能，无需手动更换）。

◆特色

●　全自动式，无需更换硅胶。常温下柜内湿度可保持在30~40% RH，适合长时间保管物品。

●　隔板位置可根据保管物品的大小进行调整。（15格，每格28 mm）

◆产品列表

*有效的内部尺寸（mm）：255W×338D×452H　
*外部尺寸（mm）：扣锁款 317W×392D×617H

*重量：约7 kg

※ 本页面产品仅供研究用，研究以外不可使用。