化学稳定性高的耐光性近红外荧光染料
PREX710-NHS (Super PhotoStable Dye)
PREX710是一种高体内稳定性的耐光性近红外染料，可用于体内荧光成像、单分子成像、抑制叶绿体自发荧光影响的植物成像以及多重染色。本试剂具有NHS酯结构，可特异性标记氨基。
※ 本产品基于名古屋大学多变生物分子研究所（ITbM）山口茂弘教授、多喜正泰特任准教授的研究成果，由funakoshi株式会社进行商品化
※ 并销售。
※ 本产品仅供研究用，研究以外不可使用。
◆近红外染料在成像中的优点及现有染料的问题
荧光成像是现代生物学中必不可少的技术，目前已研发出各种荧光染料。其大部分为可以被可见光激发的荧光染料，其中蓝色、绿色及红色荧光染料已得到广泛使用。但是，使用可见光作为激发光对生物样品进行荧光成像时，存在以下3个主要的问题：
① 光损害性：由于光能量较高，长时间会对观察对象产生光损害，从而影响实时成像。
② 自发荧光：在可见光激发下，除荧光染料外还可能会观察到生物物质来源的自发荧光。
③ 组织透过性：可见光的组织透过性低，在个体水平的成像中难以观察到组织深处。
为解决上述问题，波长比可见光更长的近红外染料（Near Infrared dye; NIR dye）备受期待。近红外染料一般使用700~900 nm范围内的波长作为激发光。长波长光不仅能量低，可抑制光毒性，并且由于生物物质对近红外波长的吸收小，所以自发荧光小，组织渗透性高，而被称为“生物之窗”。传统的近红外染料大部分都以花青素为基本骨架。由于花青素染料系（典型例子：吲哚菁绿）在生物体内的化学稳定性低，且缺乏光稳定性，以及在生物样品中分解快、褪色快，导致在生物样品中的荧光成像不充分。
PREX710作为一种新型的近红外染料，由于使用的是向氧杂蒽骨架引入氧化膦基团的新型骨架，而不是花青素骨架，所以能维持在血液中的化学稳定性，且表现出较高的光稳定性。其有望成为新型的近红外染料，应用于如体内成像等生物样品的长时间成像。
◆PREX710-NHS染料结构
本试剂将NHS酯引入到PREX710染料的结构中。可对各种含氨基的样品进行标记。
参考文献
Grzybowski, M., et al., Angew. Chem. Int. Ed., 57(32), 10137～10141 (2018). [PMID: 29984448]
A Highly Photostable Near-Infrared Labeling Agent Based on a Phospha-rhodamine for Long-Term and Deep Imaging.
◆特点
● 激发/荧光波长：710 nm/740 nm
● 量子产率：0.12
● 与现有的近红外荧光染料相比，表现出较高的光稳定性。
● 与现有的花青素系近红外荧光染料相比，在水中和生物样品中稳定。
● 在pH4~pH10的范围内，几乎不受pH的影响。
● 由于含有NHS酯结构，可标记含氨基的样品。
● 可用于体内成像和单分子成像。
● 用于植物时，可在不受叶绿体自发荧光的影响下进行观察。
● 可与常见的蓝色荧光染料、绿色荧光染料、红色荧光染料组合使用，进行4重染色。
◆标记方法概要
本产品为棕色小瓶包装，内含1 mg的PREX710-NHS（绿色），为了稳定NHS酯，以氩气填充。一旦开封，NHS酯可能会逐渐水解，建议在本试剂开封和溶解后立即使用。
1. 小瓶开封后，请立即用DMSO或DMF进行溶解。
1. 注：由于在水中会发生水解反应，不建议溶于水。建议使用脱水级的DMSO或DMF。另外，由于NHS酯在溶液中不稳定，储备溶液请在标记样品前现配现用。
1. 因为储备溶液制备后在保存过程中可能会失去标记活性，因此不建议对其进行保存。
2. 将需要标记的含氨基样品溶解于0.1 M的碳酸盐缓冲液 (NaHCO3/Na2CO3，pH 8.3) 。
1. 注：可用磷酸缓冲液PBS代替，但不建议使用含氨基的缓冲剂（如Tris，甘氨酸等），因为NHS可能会与缓冲剂反应而使其失活。
3. 将PREX710-NHS溶液与样品溶液混合，使其至少反应1 h。
4. 通过凝胶过滤或超滤法去除未反应的PREX710染料。
1. 注：染料量及样品使用量可视情况进行优化。
标记注意事项
NHS酯与氨基反应时溶液的pH很重要，pH 8.2-8.3最为适合。当pH小于8时，氨基会质子化导致反应效率降低；当pH大于8.5时，NHS酯会发生水解而失去标记活性。
◆参考数据
■ PREX710的激发 · 荧光光谱
■ 激发光谱（蓝色），荧光光谱（红色）
■ PREX710的pH稳定性
为了评估PREX710的pH稳定性，分别检测了10 h后pH在4.2、7.4、10.3中712 nm处吸光度随时间的变化。在以上的pH条件下，几乎没有观察到吸光度的衰减，由此可推断，本试剂在生物体内的pH范围（pH4~10）中，不受pH影响。
■ PREX710的光稳定性
为了评估PREX710的光稳定性，将PREX710溶解于PBS中，使用氙灯（300 W）间歇照射后观察712 nm处吸光度的衰减情况。PREX710即使在氙灯下连续曝光2 h，也完全未观察到吸光度的变化。
■ PREX710在血清中的稳定性
为了评估PREX710在血液中的稳定性，将PREX710溶解于FBS（100%）中，观察12 h后在712 nm处的吸光度变化。PREX710在至少12小时内，在血清中的吸光度几乎没有变化，表明在血清中的稳定性高。
■ 比较蛋白标记过程中的光稳定性
作为标记模型，分别使用PREX710-NHS、花青素系竞争性染料A-NHS以及竞争性染料C-NHS对IgG抗体进行标记，氙灯（300 W）间歇照射后观察光稳定性。在使用了花青素系竞争性染料A及竞争性染料C的标记中可观察到吸光度迅速衰减，但PREX710即使在IgG抗体标记状态下，吸光度在长时间的光照射下也几乎不发生变化。
◆应用数据
■ 小鼠的体内血管成像
制备使用PREX710-NHS标记的氨基葡聚糖（平均分子量为70,000），尾静脉给药于4周龄的小鼠，使用共聚焦激光显微镜（激发/荧光波长=638 nm/667~733 nm）对使用开颅法处理的脑血管进行深部成像。PREX710在血液中可长时间稳定，由于它可在不易受血红蛋白自发荧光影响的波长下激发，成功地进行了清晰的脑血管深部成像，解决了血液成像的一大难题。
（以上数据由爱媛大学大学院医学系研究科 今村健志研究室提供）
■ 植物成像
使用经PREX710-NHS标记的八聚精氨酸R8（PREX710-R8），对小立碗藓（Physcomitrella patens）的原生质体细胞壁进行染色，并用荧光显微镜观察。在703~717 nm/754~816 nm的激发/荧光波长下观察PREX710-R8，检测到在300~400 nm/>420 nm的激发/荧光波长下叶绿素为自发荧光。通过使用PREX710可以区分叶绿体的自发荧光，从而检测到清晰的信号。由于PREX710不易受叶绿体的自发荧光影响，适用于植物成像。
■ 使用PREX710的单分子成像
构建单分子成像的模型，分别制备经PREX710-NHS和花青素系竞争性染料A-NHS标记的抗生物素蛋白，随后通过生物素偶联固定在载玻片上。点上的信号是由单个抗生物素分子引起的荧光信号。以10帧/秒的采集速度，120 s内连续追踪单分子的信号。观察到花青素系竞争性染料A标记的各个信号会逐渐衰减，到40 s后荧光信号已几乎完全消失；而经PREX710标记的各个点信号即使在单分子水平下也能连续观察120 s，并只观察到了轻微的衰减。
（以上数据由理化学研究所 岡田康志研究室提供）
