Enzo使用荧光染料检测牛主动脉细胞的自噬情况
细胞组分的降解对于维持体内平衡不可或缺，这个复杂的过程受到内溶酶体和自噬途径的调节。目前已经拥有多种试剂和报告系统研究这些途径，但是每种研究手段都有优点和局限性。最近Histochemistry and Cell Biology杂志上发表了一篇文章，Oeste和他的同事们使用Enzo的Cyto-ID® 和Lyso-ID® 染料产品检测牛主动脉内皮细胞(BAEC)中的自噬泡和内溶酶体泡。虽然他们的结果是在特定的细胞系和特定的实验条件下得到的，但是他们的发现有力证明了这些染料的使用优势，可替代或者与LC3报告系统中的染料(如monodansyl cadaverine, MDC)联用。其结果如下：
Lyso-ID信号可与LampI-GFP 和GFP8共定位，这个GFP结构包含内溶酶体靶向识别RhoB GTP酶的信号。当用chloroquine或干扰内涵体稳态的U18666A处理细胞时，共定位会持续。
· 使用RFP-LC3转染的牛主动脉内皮细胞，利用氨基酸饥饿法诱导其细胞发生自噬后，研究人员展示了Cyto-ID自噬染料与RFP-LC3的共定位结果图。尤其是当加入溶酶体蛋白酶抑制剂抑制RFP-LC3的降解，这种共定位更为明显。饥饿处理过程中，Cyto-ID信号会早于RFP-LC3的点状信号之前形成，这为自噬泡形成提供了早期检测。在饥饿期间，Cyto-ID信号会对自噬诱导剂Rapamycin及抑制剂3-methyladenine (3-MA)产生应答。
· 作者指出相比于MDC带有显著本底而没有自噬诱导的信号，Cyto-ID减少了背景色。Bampton及其同事(2005)早先曾提出，MDC会因离子捕获而在酸性部位积累，导致背景信号显著。伴随着自噬的诱导， 只有部分MDC和Cyto-ID信号重叠，反映了Cyto-ID染料标记更为特异。
· 结合应用Cyto-ID和Lyso -ID染料，Oeste和同事实验结果中预测了来源于噬溶酶体融合的共同定位信号，以及Cyto-ID和Lyso -ID染色细胞器的独特亚群。
Enzo为自噬研究提供了多种产品，包括活细胞分析试剂盒、免疫检测、化合物库和抗体，以下是其中一些产品的简介。
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产品 |
特点 |
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分析试剂盒 |
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Lyso-ID® Red detection kit (GFP-Certified®) |
适用于溶酶体和自生性溶酶体活细胞成像。长波红光易于与其它荧光探针联用，如荧光素，香豆素和GFP。极耐光漂白、不易猝灭。不会转成绿色荧光，不会发射别的荧光。 |
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Lyso-ID® Green detection kit |
该试剂盒是专门为表达RFP细胞株和罗丹明类荧光团设计的，蓝色、青色或橙黄色荧光蛋白（BFPs，CFPs，OFPs个）也可以使用。 |
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Lyso-ID® Red cytotoxicity kit (GFP-Certified®) for microplates |
快速，10-15分钟染料孵育、高通量分析。在短短的3小时内即可获得定量结果，包含药物处理过程。 |
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Cyto-ID® Autophagy detection kit |
简单、无需转染即可定量监测活细胞自噬。 |
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PROTEOSTAT® Aggresome detection kit |
定量检测错误折叠的蛋白，与神经退行性疾病、肝脏疾病和毒理学的研究相关。 |
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p62 ELISA kit |
用于自噬研究，高效、定量的p62 ELISA试剂盒，可检测低至100 pg/ml的p62进行。 |
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NBR1 ELISA kit |
率先投放市场，用于自噬研究的NBR1定量检测试剂盒，可检测65 pg/ml的 NBR1。 |
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SCREEN-WELL® Autophagy library |
不同结构和机制的化合物，用于胞内和体外研究，促进/抗自噬分子的作用机制。 |
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抗体 |
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LC3, mAb (2G6) (fluorescein labeled) |
识别所有单体（LC3-I）和PE交联（LC3-II）形式的人LC3/GABARAP 蛋白 (Atg8 同系物) 。 |
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LC3, mAb (5H3) |
识别人LC3。识别两种形式的内源性LC3。 |
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LC3B, mAb (2G6) |
识别人、小鼠、大鼠、猴和仓鼠LC3B。识别两种形式的内源性LC3B。 |
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LC3B, mAb (5F10) |
识别人、小鼠、大鼠、狗和仓鼠LC3B。识别这两种形式的内源性LC3B。 |
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小分子 |
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3-Methyladenine |
PI3激酶抑制剂，著名的自噬抑制剂。 |
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Rapamycin |
大环-三烯抗生素具有强效免疫抑制剂的活性。它与FKBP12形成的复合物结合一个效应子，从而抑制IL-2和其它生长因子。 |
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U-18666A |
可抑制胆固醇从内涵体/溶酶体运输至内质网的化合物。 |
References:
· Oeste CL, et al. Interactions between autophagic and endo-lysosomal markers in endothelial cells. Histochem. Cell. Biol. (2012) (epub ahead of print).
· Bampton ET, et al. The dynamics of autophagy visualized in live cells: from autophagosome formation to fusion with endo/lysosomes. Autophagy. (2005) 1:23–36.
· Niemann A, et al. The lysosomotropic agent monodansylcadaverine also acts as a solvent polarity probe. J Histochem Cytochem (2000) 48:251-258.
· Stenmark H (2009) Rab GTPases as coordinators of vesicle traffic. Nat Rev Mol Cell Biol (2009) 10:513-525.
