可定量观察活细胞的膜相态！

LipiORDER ＜Membrane Lipid Order Imaging Dye＞

LipiORDER是环境响应型的荧光色素，可通过成像生物膜的相态 (Lipid order）Lo/Ld实现定量观察。即使在活细胞中也显示高度化学稳定性，且可观察到各种膜结构的相态，如细胞膜、细胞内膜等。

※ 本产品由funakoshi 株式会社基于高知大学教育研究部综合科复合领域科学部门 仁子阳辅博士的研究成果商品化并销售。

※ 本产品仅供研究，研究以外不可使用。

LipiORDER成像和神经细胞染色示例

依赖生物膜相态的本试剂的荧光特性变化（左）和神经细胞神经突起部位的染色案例（右）

◆生物膜相态(Lipid order)是什么？

构成生物膜的脂质种类繁多，膜的状态因其脂质组成而大不同。例如，仅由饱和脂肪酸构成的脂质膜因密度高且包裹坚固的特点，被称为有序相（Lo）；由含有不饱和脂肪酸脂质构成的脂质膜因密度低，被称为无序相（Ld）。像这样的脂质微环境被称为相态（Lipid order)。在简单模型中，Lo和Ld分离并发生明确的相分离（如图），但由于细胞生物膜中的脂质种类繁多，不会发生图中模型所示的简单相分离，而是反映总和性质的相态。

另外，膜蛋白的存在也被认为会影响相态，而实际细胞膜上的相态更为复杂。细胞膜上的Lo有时也被称为脂筏（Lipid raft），作为生物膜的功能域备受关注。这种脂质膜相态的观察对于理解膜的生物物理学性质（如生物膜的流动性和硬度等）非常重要，期待未来能开发出针对它的分析方法。

脂质膜的相态成像

近年，Laurdan、di-4-ANEPPDHQ、Nile Red等响应分子极性并发生色调变化的荧光色素（solvatochomic dye) 已被应用于生物膜的相态可视化。由于这些分子极性响应型荧光色素会根据相态改变荧光波长，通过检测特定激发光中的两种波长的荧光获得其荧光强度比，可半定量分析相态。（详细信息，请参阅下述的“原理”）。

然而，这些试剂在实际使用中还存在如细胞内局部不均匀、对光不稳定等问题，。本产品LipiORDER利用高知大学的仁子阳辅博士和Strasbourg大学的Andrey Kylmchenko博士的团队开发的新型芘衍生物荧光探针（原著论文名PK），以及在Lo、Ld上荧光特性不同的特征，可定量分析生物膜相态。与Laurdan相比，显示极高的光稳定性，在活细胞中也能维持化学稳定性，因此活细胞成像优异。

参考：膜的相态成像应用实例

相态被认为是决定脂质膜流动性的参数，以Laurdan为首，相态成像被用于各种生命现象的分析。Laurdan会根据相态将荧光波长由蓝色（Lo）变为绿色（Ld），观察蓝色和绿色两种波长的荧光，其荧光强度比（绿色荧光强度/蓝色荧光强度）和GP值（generalized polarization；(F_blue-F_green/F_blue F_green）的计算值可用于评价相态。例如进行外部刺激（药物处理、氧化应激等）、基因操作（目的基因的过表达或敲降）引起的细胞形态结构变化及其相态的分析。此外，作为细胞功能分析的一环，还观察到了细胞类型间的相态比较。

Laurdan：在观察到两种波长的荧光后，从观察图像中计算出荧光比（或GP值），使用拟色进行比率型图像分析。

◆原理

LipiORDER是根据溶剂的分子极性改变荧光特性的溶剂极性响应型荧光色素（Solvatochromic fluorescent dye)（图1）。此外，本试剂对脂质膜具有高亲和性，浓缩在细胞的膜结构中。通过这两个特点，本试剂根据膜内部的极性将荧光由绿色变为红色。相态反映了脂质的包裹密度，稀疏包裹的Ld极性高，而紧密包裹的Lo极性低，通过观察膜结构的极性可定量观察相态（图2上）。实际上，与模型Lo相（sphingomyelin/Cholesterol; SM/Chol）显示绿色荧光（荧光波长最大~510 nm）相对，模型Ld相（dioleylphosphatidylcholine；DOPC）发生长波长偏移，显示红色荧光（荧光波长最大~575 nm）（图2下）。另外，在被认为是SM/Chol与DOPC中间模型的DOPC/Chol中，观察到SM/Chol与DOPC中间的荧光光谱，可通过观察本试剂获得的绿色荧光强度F_G（荧光显微镜中的检测波长范围约为500~550 nm）和红色荧光强度F_R（检测波长范围约550~650 nm）的荧光强度比F_R/F_G，相对定量膜相态。

图1. 溶剂的分子极性依赖性荧光响应性

图2. 溶剂的分子极性依赖性荧光响应性

上图：根据相态的荧光特征变化图  下图：模型脂质体中的荧光光谱

◆特点

●　由405 nm激发产生的绿色荧光强度F_G（500~550nm）和红色荧光强度F_R（550~650nm）的荧光强度比F_R/F_G和相态之间存在相关性。

●　※ 本试剂几乎不被488 nm激光吸收，可作为激发488 nm以上的光的荧光色素使用。

●　显示出的性质：荧光比F_R/F_G的值越大，则越接近无序相Ld状态；F_R/F_G值越小，则越接近有序相Lo状态。

●　极性响应型荧光色素，在低极性环境中发出荧光。在水溶液中不发出荧光，在高S/N比下可观察到膜结构和脂肪滴。

●　只需将本试剂添加至活细胞中，即可摄入至细胞膜、内膜和脂肪滴，并会根据膜的相态表现出不同的荧光特性。

●　拥有脂质体模型、培养细胞和斑马鱼的染色实绩。

●　※ 有关斑马鱼的染色情况，请参考原著论文。

●　已确认本试剂的荧光特性几乎不受蛋白、多糖等的影响。

●　与现有的分子极性响应型荧光色素Laurdan相比，显示更高的光稳定性。

◆原著论文

Valanciunaite et al., Anal. Chem., 92, 6512-6520 (2020)　Polarity Mapping of Cells and Embryos by Improved Fluorescent Solvatochromic Pyrene Probe.

◆观察注意事项

生物膜相态是通过荧光比来定量的，所以需要检测在405 nm激发下的两种波长的荧光。同时在Green频道约500-550 nm和Red频道约550-650 nm获得荧光，再使用各种分析软件算出荧光比。为获取荧光比，在每次荧光观察时需注意不能使信号饱和。这种色素在488 nm、560 nm处不吸收，所以可与一般的绿色、红色和近红外荧光发生共染色。建议获取以下溶液的荧光图像作为校准对照：

◆应用数据

■　活细胞成像

添加LipiORDER（300 nM in HBSS）至COS7细胞中，培养10 min后用激光共聚焦显微镜获取两种波长的荧光图像（激发光：405 nm；荧光Green：470-550 nm，Red：550 nm~）。通过ImageJ对绿色荧光图像和红色荧光图像进行比率测量分析（荧光比F_R/F_G），并用假色（Lo■■■■■■■Ld）可视化相态。细胞膜的F_R/F_G低，估计在ER等细胞内膜中F_R/F_G高。

Heat map的详细分析结果。

将比率测量分析图像的各个热图层抽出，并分析。

■　观察神经细胞膜的相结构

添加LipiORDER（300 nM in HBSS）至E17.5小鼠来源的海马原代神经细胞（DIV3或DIV12）中，培养10 min后用激光共聚焦显微镜获取两种波长的荧光成像（激发光：405 nm、荧光Green：470~550 nm，Red：550 nm~）。通过ImageJ对绿色荧光图像和红色荧光图像进行分析（荧光比F_R/F_G），并用假色（Lo■■■■■■■Ld）可视化相态。通过比率测量分析，可观察到在所有膜结构中，细胞膜的F_R/F_G低，与Lo的环境接近；内膜结构的F_R/F_G高，与Ld的环境接近。

■各个图像的荧光观察图像以及比例分析的应用。

在激光共聚焦显微镜的405 nm激发光下，使用绿色荧光图像（470-550 nm）和红色荧光图像（550 nm以上），并通过ImageJ算出比率测量分析图像。

将比率测量分析图像的疑似色热图阶段性分割，可以看出，F_R/F_G（接近Lo）的信号，随着荧光比率不断增大（接近Ld），会距离细胞膜越来越远。

■　观察依赖于细胞外刺激的膜相态变化

用胆固醇去除剂的β-cyclodextrin（β-CD; 15 mM）处理COS7细胞4 h，清洗细胞，并添加LipiORDER（300 nM in HBSS），培养细胞10 min后用激光共聚焦显微镜获取两种波长的荧光图像（激发光：405nm，荧光Green：470-550nm，Red：550nm~）。通过ImageJ对绿色荧光图像和红色荧光图像进行比率测量分析（荧光比F_R/F_G），并用拟色（Lo■■■■■■■Ld）可视化相态。通过β-CD处理可观察到细胞结构的显著变化，提取热图的深绿色层（荧光比0.06-0.34）时，发现其分布发生了很大的变化。

※ 上述细胞染色数据，由名古屋市立大学大学院 药学研究科 服部光治教授提供。

■　光稳定性

比较现有的分子极性检测试剂Laurdan和LipiORDER的光稳定性。与Laurdan表现出显著的光衰减相比，LipiORDER即使在暴露1 h后仍保持稳定。该试剂也可用于长期成像。

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