microRNA和piRNA研究

AGO蛋白家族

AGO蛋白家族是指与以小分子RNA(small RNA)为介质的遗传基因发现控制机构有关的蛋白质群。基于氨基酸序列的相似性，AGO蛋白家族又分为AGO亚族与PIWI亚族，已发现在生殖细胞、干细胞（ES、iPS等）中有表达。

和光纯药公司推出了众多用于对miRNA和mRNA （存在于细胞和组织中的RISC的组成成分）进行功能分析的工具，这些工具不仅适用于对miRNA的分析，同时也适用于对靶标mRNA的分析。

●       1. microRNA研究
　　（1）microRNA纯化试剂盒系列：
　　（2）cDNA编码microRNA试剂盒的制备
　　（3）抗体

●       2. piRNA研究

【和光产品信息】

1. microRNA研究

microRNA（简称miRNA）是一种长约22个nt（核苷酸）的内源性RNA分子，通过与靶标mRNA的互补配对，可抑制mRNA的裂解和翻译，从而在动植物体内发挥重要的调控作用。据推测，在人体和鼠体内存在上千种miRNA，因此对于miRNA的各种研究（例如对功能不明的新型miRNA的鉴定以及对与特定疾病相关的miRNA功能的说明等）迅速发展成为一大研究领域。近来，血清中存在miRNA这一重大事实的发现，开创了利用miRNA作为生物标志物进行包括癌症在内的疾病治疗的医学未来。一般认为，microRNA发挥作用的方式如下： 先在细胞中经过多个阶段发育成熟，再与蛋白质结合生成蛋白质复合物“RISC”（“RNA诱导沉默复合物”），然后与RISC主要组成部分AGO亚族蛋白结合，最后再与靶标mRNA结合，从而达到降解mRNA链或抑制翻译的目的。

人体中存在4种AGO亚族蛋白（hAgo1～hAgo4），可泛表达基因信息，但表达水平因类型而异。在AGO亚族蛋白中，只有AGO2具备对靶标RNA裂解的切割酶活性，因此是一种十分具表达水平的蛋白质，可在miRNA合成途径中发挥至关重要的作用。由于RISC能够与AGO蛋白抗体发生免疫沉淀，因此可从RISC沉淀物中回收miRNA；而且进一步研究表明，靶标miRNA为共沉淀剂，因此免疫沉淀成法为研究miRNA功能的基本方法。

鉴于上述情况，和光纯药特别推出了众多对miRNA功能进行分析的工具，其中主要为利用抗AGO抗体的miRNA研究工具。通过组合使用上述工具，即可实现对miRNA和mRNA（存在于细胞和组织中的RISC的组成成分）的综合分析— miRNA分析和靶标mRNA分析。

（1） microRNA纯化试剂盒系列：

一种基于利用AGO蛋白抗体的免疫沉淀方法

特点：

• 1）适用于内源性AGO蛋白的免疫沉淀法

• 2）miRNA与AGO蛋白结合的纯化性能高

• 3）其他RNA（如rRNA（核糖体）和RNA的降解片段）的污染度低

• 4）适用于microRNA的高效克隆以及纯化microRNA成分的微阵列技术（测定基因表达谱的方法和技术）

• microRNA提取试剂盒，人/鼠AGO1（10次反应；和光Cat.No.：291-70201）

• microRNA提取试剂盒，人AGO2（10次反应；和光Cat.No.：292-66701）

• microRNA提取试剂盒，鼠AGO2（10次反应；和光Cat.No.：292-67301）

• microRNA提取试剂盒，人AGO3（10次反应；和光Cat.No.：297-70301）

（2）cDNA编码microRNA试剂盒的制备

和光纯药microRNA克隆试剂盒可以用于制备cDNA编码microRNA，只需在microRNA片段制备后的1.5日之内即可完成克隆过程。该试剂盒中含有从虾中提取的碱性磷酸酶（SAP），能与其中的耐热性单链DNA连接酶（另售）和原改良接头发生连接反应。与传统方法（利用从细菌中提取的碱性磷酸酶和T4 RNA连接酶）相比，克隆效率显著提高。

特点：

• 1） 耐热性连接酶能够实现接头的准确连接，从而提高克隆效率

• 2） 适用于microRNA克隆以形成二级结构

• 3） 操作简单，只需在1.5日之内即可生成cDNA编码microRNA

• 和光microRNA克隆试剂盒（8次反应；和光Cat.No.：290-66501）
  接头连接高效、准确、简捷

• 耐热性单链DNA连接酶重组体解决方案（200个单位（和光Cat.No.：298-65103）；500个单位（和光Cat.No.：292-65101）

• 和光靶标mRNA克隆试剂盒（10次反应；和光Cat.No.：298-68001）
  和光纯药生产的靶标mRNA克隆试剂盒用于借助微量mRNA实现cDNA扩增，尤其是利用AGO IP RNA片段实现microRNA靶标mRNA克隆。扩增后的cDNA将成为microRNA的靶标mRNA。 　　　

  　

特点：

• 1）方法简易

• 2）具备实现微量mRNA扩增的性能

• 3）cDNA扩增方式不依赖于mRNA的长度

• 4）适用于microRNA靶标mRNA的研究

• 和光PCR纯化试剂盒（30次反应（和光Cat.No.：298-67901）
  和光纯药生产的PCR纯化试剂盒，用于在利用RT-PCR或PCR完成DNA合成后的仅10分钟内去除在各种分子生物学试验反应缓冲液中形成的引物、引物二聚体、dNTP（三磷酸脱氧核苷酸）以及诸如DNA聚合酶、限制性内切酶等多种酶。

• THUNDER Taq Gold DNA聚合酶（不含镁离子的缓冲液）
  （250个单位；和光Cat.No.：317-07081）：PCR（聚合酶链式反应）用耐热性DNA聚合酶
  建议采用THUNDER Taq Gold DNA聚合酶（不含镁离子的缓冲液）来抑制非特异性扩增。THUNDER Taq Gold DNA聚合酶用于PCR的热启动，在进入PCR循环前，在95℃的温度下经过10分钟的热处理后被活化。由于利用THUNDER Taq Gold DNA聚合酶（不含镁离子的缓冲液）方式实现扩增后的DNA片段是一种腺嘌呤的3'末端， 因此能够直接插入到T载体中。
  

（3） 抗体

• AGO1抗体、单克隆抗体（1F2）
  　（50 μL（和光Cat.No.：018-22401））〈用于蛋白质印迹法〉

• AGO1抗体、单克隆抗体（2A7）
  　（50 μL（和光Cat.No.：015-22411））〈用于免疫沉淀法〉

• 抗人AGO2抗体、单克隆抗体（4G8）
  　（50 μL（和光Cat.No.：011-22033）；100 μL（和光Cat.No.：015-22031）
  　〈用于蛋白质印迹法、免疫沉淀法以及免疫细胞化学染色法〉

• 抗小鼠AGO2抗体、单克隆抗体（2D4） 
  　（50 μL（和光Cat.No.：014-22023）；100 μL（和光Cat.No.：018-22021） 
  　〈用于蛋白质印迹法、免疫沉淀法以及免疫细胞化学染色法〉

• 抗人AGO3抗体、单克隆抗体（1C12） 
  　（50 μL（和光Cat.No.：018-23241））〈用于免疫沉淀法〉

2. piRNA研究

• 与Piwi蛋白相作用的RNA称为piRNAs

• PIWIL1抗体、单克隆抗体（2C12）
  (100 μL （和光Cat.No.：017-23451））〈用于免疫沉淀法〉

特点：

• 1) 可免疫沉淀内在性PIWIL1蛋白质。（5～10 µg浓度为10%的蛋白G微珠）

• 2) 可免疫沉淀PIWI1结合piRNA。

• 3) 可在人、鼠的组织和细胞中使用。

使用例：

(1) 小鼠精巢中内源性PIWIL1的免疫沉淀（IP)-1

Lane 1: NEC14 cells, mouse IgG IP分级 (1/2 vol.)
Lane 2: NEC14 cells, 2C12 IP分级 (1/2 vol.)
Lane 3：小鼠 精巢 IgG IP分级 (1/2 vol.)
Lane 4：小鼠精巢, 2C12 IP分级 (1/2 vol.)

Cell number: 1 x 10⁷ cells
组织（小鼠精巢）重量 25mg
第一抗体（蛋白质印迹）
  Anti PIWIL1 polyclonal antibody 
    (gifted from Dr. Miyagawa, Osaka Univ.) 
    This antibody is not available from Wako. 

(2) 小鼠精巢中内源性PIWIL1的免疫沉淀（IP)-2

Lane M：分子量Marker
Lane 1：小鼠IgG IP分级 (1/2 vol.)
Lane 2: 2C12 IP分级 (1/2 vol.)
组织（小鼠精巢）重量 25mg
第一抗体（蛋白质印迹）
  Anti PIWIL1 polyclonal antibody 
    (gifted from Dr. Miyagawa, Osaka Univ.) 
    This antibody is not available from Wako.

(3) PIWIL1结合piRNA的精制

Lane M：分子量Marker
Lane 1：小鼠IgG IP RNA 分级 (1/2 vol.)
Lane 2: 2C12 IP RNA 分级 (1/2 vol.)

组织（小鼠精巢）重量 25mg 8P)

microRNA（简称miRNA）是一种长约22个nt（核苷酸）的内源性RNA分子，通过与靶标mRNA的互补配对，可抑制mRNA的裂解和翻译，从而在动植物体内发挥重要的调控作用。据推测，在人体和鼠体内存在上千种miRNA，因此对于miRNA的各种研究（例如对功能不明的新型miRNA的鉴定以及对与特定疾病相关的miRNA功能的说明等）迅速发展成为一大研究领域。近来，血清中存在miRNA这一重大事实的发现，开创了利用miRNA作为生物标志物进行包括癌症在内的疾病治疗的医学未来。一般认为，microRNA发挥作用的方式如下： 先在细胞中经过多个阶段发育成熟，再与蛋白质结合生成蛋白质复合物“RISC”（“RNA诱导沉默复合物”），然后与RISC主要组成部分AGO亚族蛋白结合，最后再与靶标mRNA结合，从而达到降解mRNA链或抑制翻译的目的。
人体中存在4种AGO亚族蛋白（hAgo1～hAgo4），可泛表达基因信息，但表达水平因类型而异。在AGO亚族蛋白中，只有AGO2具备对靶标RNA裂解的切割酶活性，因此是一种最具表达水平的蛋白质，可在miRNA合成途径中发挥至关重要的作用。由于RISC能够与AGO蛋白抗体发生免疫沉淀，因此可从RISC沉淀物中回收miRNA；而且进一步研究表明，靶标miRNA为共沉淀剂，因此免疫沉淀成法为研究miRNA功能的基本方法。
鉴于上述情况，和光纯药特别推出了众多对miRNA功能进行分析的工具，其中主要为利用抗AGO抗体的miRNA研究工具。通过组合使用上述工具，即可实现对miRNA和mRNA（存在于细胞和组织中的RISC的组成成分）的综合分析— miRNA分析和靶标mRNA分析。

（1） microRNA纯化试剂盒系列：

一种基于利用AGO蛋白抗体的免疫沉淀方法

特点：

• 1）适用于内源性AGO蛋白的免疫沉淀法

• 2）miRNA与AGO蛋白结合的纯化性能高

• 3）其他RNA（如rRNA（核糖体）和RNA的降解片段）的污染度低

• 4）适用于microRNA的高效克隆以及纯化microRNA成分的微阵列技术（测定基因表达谱的方法和技术）

• microRNA提取试剂盒，人/鼠AGO1（10次反应；和光Cat.No.：291-70201）

• microRNA提取试剂盒，人AGO2（10次反应；和光Cat.No.：292-66701）

• microRNA提取试剂盒，鼠AGO2（10次反应；和光Cat.No.：292-67301）

• microRNA提取试剂盒，人AGO3（10次反应；和光Cat.No.：297-70301）

（2）cDNA编码microRNA试剂盒的制备

和光纯药microRNA克隆试剂盒可以用于制备cDNA编码microRNA，只需在microRNA片段制备后的1.5日之内即可完成克隆过程。该试剂盒中含有从虾中提取的碱性磷酸酶（SAP），能与其中的耐热性单链DNA连接酶（另售）和原改良接头发生连接反应。与传统方法（利用从细菌中提取的碱性磷酸酶和T4 RNA连接酶）相比，克隆效率显著提高。

特点：

• 1） 耐热性连接酶能够实现接头的准确连接，从而提高克隆效率

• 2） 适用于microRNA克隆以形成二级结构

• 3） 操作简单，只需在1.5日之内即可生成cDNA编码microRNA

• 和光microRNA克隆试剂盒（8次反应；和光Cat.No.：290-66501）
  接头连接高效、准确、简捷

• 耐热性单链DNA连接酶重组体解决方案（200个单位（和光Cat.No.：298-65103）；500个单位（和光Cat.No.：292-65101）

• 和光靶标mRNA克隆试剂盒（10次反应；和光Cat.No.：298-68001）
  和光纯药生产的靶标mRNA克隆试剂盒用于借助微量mRNA实现cDNA扩增，尤其是利用AGO IP RNA片段实现microRNA靶标mRNA克隆。扩增后的cDNA将成为microRNA的靶标mRNA。 　　　

  　

特点：

• 1）方法简易

• 2）具备实现微量mRNA扩增的性能

• 3）cDNA扩增方式不依赖于mRNA的长度

• 4）适用于microRNA靶标mRNA的研究

• 和光PCR纯化试剂盒（30次反应（和光Cat.No.：298-67901）
  和光纯药生产的PCR纯化试剂盒，用于在利用RT-PCR或PCR完成DNA合成后的仅10分钟内去除在各种分子生物学试验反应缓冲液中形成的引物、引物二聚体、dNTP（三磷酸脱氧核苷酸）以及诸如DNA聚合酶、限制性内切酶等多种酶。

• THUNDER Taq Gold DNA聚合酶（不含镁离子的缓冲液）
  （250个单位；和光Cat.No.：317-07081）：PCR（聚合酶链式反应）用耐热性DNA聚合酶
  建议采用THUNDER Taq Gold DNA聚合酶（不含镁离子的缓冲液）来抑制非特异性扩增。THUNDER Taq Gold DNA聚合酶用于PCR的热启动，在进入PCR循环前，在95℃的温度下经过10分钟的热处理后被活化。由于利用THUNDER Taq Gold DNA聚合酶（不含镁离子的缓冲液）方式实现扩增后的DNA片段是一种腺嘌呤的3'末端， 因此能够直接插入到T载体中。
  

（3） 抗体

• AGO1抗体、单克隆抗体（1F2）
  　（50 μL（和光Cat.No.：018-22401））〈用于蛋白质印迹法〉

• AGO1抗体、单克隆抗体（2A7）
  　（50 μL（和光Cat.No.：015-22411））〈用于免疫沉淀法〉

• 抗人AGO2抗体、单克隆抗体（4G8）
  　（50 μL（和光Cat.No.：011-22033）；100 μL（和光Cat.No.：015-22031）
  　〈用于蛋白质印迹法、免疫沉淀法以及免疫细胞化学染色法〉

• 抗小鼠AGO2抗体、单克隆抗体（2D4） 
  　（50 μL（和光Cat.No.：014-22023）；100 μL（和光Cat.No.：018-22021） 
  　〈用于蛋白质印迹法、免疫沉淀法以及免疫细胞化学染色法〉

• 抗人AGO3抗体、单克隆抗体（1C12） 
  　（50 μL（和光Cat.No.：018-23241））〈用于免疫沉淀法〉

2. piRNA研究

• PIWIL1抗体、单克隆抗体（2C12）
  (100 μL （和光Cat.No.：017-23451））〈用于免疫沉淀法〉

特点：

• 1) 可免疫沉淀内在性PIWIL1蛋白质。（5～10µg浓度为10%的蛋白G微珠）

• 2) 可免疫沉淀PIWI1结合piRNA。

• 3) 可在人、鼠的组织和细胞中使用。

使用例：

(1) 小鼠精巢中内源性PIWIL1的免疫沉淀（IP)-1

Lane 1: NEC14 cells, mouse IgG IP分级 (1/2 vol.)
Lane 2: NEC14 cells, 2C12 IP分级 (1/2 vol.)
Lane 3：小鼠 精巢 IgG IP分级 (1/2 vol.)
Lane 4：小鼠精巢, 2C12 IP分级 (1/2 vol.)

Cell number: 1 x 10⁷ cells
组织（小鼠精巢）重量 25mg
第一抗体（蛋白质印迹）
  Anti PIWIL1 polyclonal antibody 
    (gifted from Dr. Miyagawa, Osaka Univ.) 
    This antibody is not available from Wako. 

(2) 小鼠精巢中内源性PIWIL1的免疫沉淀（IP)-2

Lane M：分子量Marker
Lane 1：小鼠IgG IP分级 (1/2 vol.)
Lane 2: 2C12 IP分级 (1/2 vol.)
组织（小鼠精巢）重量 25mg
第一抗体（蛋白质印迹）
  Anti PIWIL1 polyclonal antibody 
    (gifted from Dr. Miyagawa, Osaka Univ.) 
    This antibody is not available from Wako.

(3) PIWIL1结合piRNA的精制

Lane M：分子量Marker
Lane 1：小鼠IgG IP RNA 分级 (1/2 vol.)
Lane 2: 2C12 IP RNA 分级 (1/2 vol.)
组织（小鼠精巢）重量 25mg