免疫肿瘤学实用研究工具

◆通过免疫系统抵抗癌症

免疫肿瘤学，也称作癌症免疫疗法，旨在使用患者自身的免疫系统进行癌症治疗。在过去十年里，关于免疫系统在控制肿瘤发生和肿瘤发展的研究表明，癌组织中的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），特别是CD8⁺ 细胞毒性T细胞的存在，以及CD8⁺ 效应T细胞/CD4⁺ /叉头样转录因子P3⁺调节性T细胞（Tregs）的比例，似乎与改善许多实体瘤患者的预后和长期生存有关。然而，激活T细胞需要两种信号：1）通过T细胞受体（TCR）识别抗原肽/主要组织相容性复合物（MHC）；2）由抗原呈递细胞（APCs）上表达的协同信号分子与其T细胞表达的受体之间的相互作用诱导的抗原非依赖性共刺激。T细胞激活也可以被存在于APCs上的共抑制分子（称为免疫检查点）负调节，这是维持自身耐受性并调节在正常条件下免疫应答的持续时间和程度的关键机制。具有多种TCR组成成分的T细胞在体内长期循环，寻找在细胞表面上因感染或癌症而呈现的外源多肽。当T细胞遇到肿瘤抗原时，通常会导致T细胞的激活、克隆性增殖/扩增和细胞溶解反应。但是，由于抗原识别受损或肿瘤产生的高度免疫抑制性微环境，导致肿瘤免疫相互作用可能失调，最终导致免疫逃避。

针对各种免疫耐受机制及其组合的药物治疗已经得到卫生当局的批准，并且仍在积极研究中。目前正在开发的大多数免疫治疗药物可大致分为：（1）通过阻断负调控信号（例如共抑制免疫检查点）靶向肿瘤免疫逃避的药物；（2）直接刺激免疫原性通路的药物（例如共刺激受体激动剂）。其他免疫刺激方法包括抗原呈递的增强剂（例如疫苗），使用外源性重组细胞因子、溶瘤病毒，以及使用天然或经修饰的具有抗原能力的免疫细胞的细胞疗法。Enzo致力于为客户科研而服务。我们集结了多元化的科学与技术专业知识，通过研发新的试剂，支持接下来十年或以后的癌症研究。Enzo一如既往地持续致力于给未来带来更多希望，更多合作，更多发现和更少的疾病。

◆通过共抑制免疫检查点靶向免疫耐受

PD-1/PD-L1axis：PD-1是一种共抑制受体，在活化的T细胞、B淋巴细胞、自然杀伤（NK）细胞和髓源性抑制细胞(MDSCs)中高度表达。在免疫反应的效应阶段，PD-1表达由TCR-抗原衔接和常见的γ-链细胞因子（如白细胞介素（IL）-2，IL-7，IL-15和IL-21）诱导的。PD-1具有两种已知配体，PD-L1与PD-L2，它们的结合导致了效应T细胞的衰竭与凋亡。此外， PD-1与PD-L1在肿瘤上的结合，可能使肿瘤细胞对细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的裂解和Fas诱导的细胞凋亡具有抵抗力。PD-L1的表达与上调，例如通过激活关键的致癌通路，包括磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和有丝分裂原激活蛋白激酶（MAPK）已经证实存在于抗肿瘤免疫压力或促炎环境的各种肿瘤。STAT1、IFN regulatory factor-1调节干扰素γ (IFN-γ) and IL-4等促炎细胞因子的表达，最终导致上调其中有几种PD-1或PD-L1靶向的单克隆抗体用于治疗多种实体瘤，但是黑素瘤和非鳞状非小细胞肺癌（NSCLC）患者似乎更受益于PD-1/PD-L1轴阻断。

LAG-3：作为Ig超家族中的一员，LAG-3在活化T细胞（CD4⁺ 和CD8⁺）和NK 细胞上的T细胞跨膜受体。它与MHCII类（MHC-II）分子，并且还与T细胞上的TCR/ CD3复合物相互作用，从而抑制钙对CD3刺激的反应。LAG-3的阻滞促进T细胞活化，增殖和效应子功能。

TIM-3：TIM-3在分泌IFN-γ的辅助T细胞1 CD4⁺ 和CD8⁺ T细胞以及辅助T细胞17产生。TIM-3表达通过抗原刺激和响应促炎细胞因子而上调。Galectin-9是TIM-3的配体，与TIM-3相互作用诱导耐受性和T细胞衰竭。在鼠类模型中，与其他单一疗法相比，抗Tim-3和抗PD-L1抗体的组合疗法能够带来更为可观的抗癌免疫应答和减小肿瘤大小。

CTLA-4：在抗原启动的引发阶段以及TCR抗原肽复合物结合后，表面的CTLA-4充当T细胞的负调节受体。CTLA-4的水平在T细胞亚型中是可变的，并且由钙/钙调磷酸酶诱导的转录因子NFATc1调节。CTLA-4是CD28的同源物，CD28是T细胞上的关键共刺激受体，因此它竞争相同的配体——CD80和CD86的结合。但是，与CD28相比，CTLA-4对这两种配体有着更高的亲和力，因此干扰了免疫突触和T细胞失活。治疗性抗CTLA-4单克隆抗体通过恢复T细胞上的CD28依赖性激活和促进肿瘤微环境中Tregs的消耗，在黑素瘤晚期中展现出显著的疗效。

◆通过共刺激免疫检查点通路增强免疫反应

GITR：与下面提到的其他共刺激受体相似，GITR是肿瘤坏死因子受体超家族的成员。它存在于各种类型的免疫细胞表面，包括Tregs、效应T细胞、B淋巴细胞、NK细胞和活化树突状细胞 。GITR的激活增强T细胞、NK细胞、APCs和B淋巴细胞的功能，并促进TCR CD4和CD8⁺ T细胞的增殖，减少Treg介导的抑制作用。经证明，GITR激动性抗体与PD-1阻断组合在鼠类模型中具有协同作用。

OX40：虽然OX40在静止或未激活的T细胞中不表达，但在TMP / CD3交联反应中以及肿瘤微环境中存在促炎性细胞因子的情况下，CD4⁺ 和CD8⁺ T细胞在抗原引发阶段均高度上调。在实验模型中OX40受体与其配体OX40L或激动性抗体的结合诱导效应T细胞应答的增殖与活化，以及肿瘤消退。

4-1BB：4-1BB产自多种免疫细胞类型，并在激活CD8⁺ 和CD4⁺ T细胞时瞬时上调。近期研究结果表明，4-1BB激动剂可以将Tregs重编为具有抗癌活性的细胞毒性CD4⁺ T细胞。此外以证明，4-1BB激动剂可以在集中小鼠模型中诱导肿瘤消退，当与其他免疫疗法（如负调节检查点拮抗剂、溶瘤病毒、T细胞治疗）相结合时效果更为显著。

CD40：CD40在APCs（如树突细胞、活化的单核细胞和巨噬细胞）中产生，并与CD40配体（CD40L，CD154）结合，后者主要在活化的CD4⁺ T细胞上表达。CD40/CD40L通路已被提议作为适应性免疫应答启动的关键步骤，在鼠类模型以及早期临床试验中，CD40激动剂均显示出抗肿瘤免疫反应。

Enzo为肿瘤免疫研究提供一套完整设备，包括抗体、ELISA试剂盒以及重组蛋白。阅读我们的免疫与癌症版面获取更多信息以及成功试验提示。此外，可联系我们的技术支持团队以获得更多帮助。

◆产品列表

研究用的肝毒性与药物性肝损伤检测

提示：PEVIVA系列试剂盒仅供研究使用 

为了降低候选药物戒断风险，以及减少未来的监测研究中显示出不良肝副作用的药物，潜在肝毒性检测是药物研发与药物安全性测试中必不可少的步骤。

标准的肝损伤生物标志物，如丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST），灵敏度和特异性不足，预测价值有限。在临床前药物研发期间，没有肝损伤的情况下仍然可以观察到AST/ALT的上升。相反，即使发生了组织损伤，转移酶却没有增加。在安全性研究中，约40%的药物性肝损伤（DILI）研究对象未被检测出，因此新生物标志物亟待推出。

Ximelagatran是一种口服直接凝血酶抑制剂，仍在研发中，也已在多个国家/地区上市。该药物在获批前，已经在广泛的临床前和临床程序中进行了测试，然而最终却由于肝毒性报告而退出市场。这种肝毒性作用在各种模型中的临床前毒理学计划以及后来III期临床试验中的短期使用均未显示出，直到长期使用后增加了肝实验室测试（如ALT升高）才被发现。当时的标准临床前毒理学研究未能指出Ximelagatran影响肝功能的迹象。其中究竟花费了多少资金？虽然无法知晓其准确数字，但据估计，将一种新药从替补席转到货架上的成本现在已经超过40亿美元。显然，在药物研发中需要更好的生物标志物。

预测安全性检测协会（PSTC）和国际安全计划（IMI）

为减轻标准肝试验的问题，PSTC与IMI合作，正在验证新型肝损伤生物标志物。在化验调查中，被Caspase切割的总角蛋白18（ccK18）和总角蛋白18（K18）被研究用于药物研发的监管决策过程，并且用作潜在药物安全性测试。

K18研究生物标志物的特征

●  当肝脏定义为起源的器官时，K18特异性优于ALT

●  富含于肝脏组织中

●  对照样本的日常波动小

●  取样后在血清/血浆中非常稳定

●  在循环中的半衰期相对较短，适用于检查药物的作用

●  提供有关肝细胞损伤（凋亡和/或坏死）的有效机械信息

海洋毒素研究的乐趣

东北大学名誉教授、一般财团法人日本食品分析中心顾问 

安元健

受FUJIFILM Wako之邀，笔者获得了介绍自己研究的课题——海洋生物毒素的机会。海洋生物毒素拥有丰富多彩的面孔，阐明其化学结构和药理作用、针对其在食品卫生和公共卫生方面的措施、阐明其生态和生物学意义等研究都有着重要意义。虽然笔者最为关注的是“毒素的化学结构”，但是寻找 “毒素的产生者”的过程也十分有趣。就像微生物产生毒素，然后通过食物链扩散一样，研究对象的毒素也相互联系在一起。笔者将在本文中向大家科普介绍天然海洋毒物，也会介绍与笔者相关的个人经历。

◆雪卡毒素（Ciguatera）

在笔者高三最后的暑假期间，与渔民谈论的“醉鱼”现象是笔者“海洋毒素研究”的起点。

本着享受暑假的想法，在咨询了好友后，笔者来到了冲绳北边一个偏远的小岛——伊平屋岛。虽然每天都在海里游泳和钓鱼，但是不时会为了了解潮汐等的海况去拜访渔民。每次去拜访渔民所听到的关于鱼的种类和习性的话题都让笔者觉得十分的有趣。其中，关于“醉鱼”的话题让笔者产生了浓厚的兴趣。首先，一般中毒时会使用“中毒了”来表达而不会用“醉”的说法。而用“醉鱼“的“醉”表达了由于食用鱼后产生了身体疲乏、关节疼痛，类似于宿醉一样的症状，因而用“醉”来表达。更奇妙的是，如果这时候触碰水的话，会如触电一般地疼痛。中毒不仅限于特定的鱼类，食用许多种类都会“醉“且与鱼类新鲜度方面没有问题，不过由于该现象具有极地性，毒化区域会不时移动。后来，笔者了解到这种在加勒比海，印度洋和太平洋的珊瑚礁中多发的特异性中毒为“雪卡毒素”中毒。当许多前往新大陆的船只停泊在加勒比海地区时，就会出现多起船员食用鲜鱼引起的中毒事件。由于这种现象一直不清楚产生的原因，因此自哥伦布时期以来就一直被当做是神秘的中毒现象。在第二次世界大战期间，由于在太平洋的日美士兵大部分都中毒了，这件事才引起了多方的关注。

a.毒化原因

含有毒素的鱼没有像河豚一样的物种特异性，而且由于个体差异和地域差异较大，所以会被认为是食物来源中毒。但产生毒素的生物和毒素的化学性质却都是未知的。自1950年代后期以来，法属波利尼西亚为了建立旅游基地或军事基地不断地开发小岛，伴随小岛的开发，中毒事件呈爆发式增长。因此，在冲绳有调查“醉鱼”经验的笔者被聘任为WHO的顾问派遣至法属波利尼西亚。由于假设为食物来源的毒素，所以研究人员首先对鱼胃肠道的内容物进行了显微镜观察和毒性测试，发现出现在胃中的圆盘状单细胞生物与鱼的毒性呈现高度相关性。在毒性特别高的甘比尔群岛，由于建设跑道和开设航线进行了土木工程，工程中的沉积沙土杀死了大部分珊瑚，并被石灰藻覆盖。在这些石灰藻表面覆盖着生长了许多刚才所提到的圆盘状的生物（图1）。

这种生物是一种称为沟鞭藻的单细胞生物中的新属新种。根据采集地、圆盘状的形状及其毒性，我们将其命名为Gambierdiscus toxicus。从海底采集的G. toxicus 和从有毒鱼中提取和纯化的成分在NMR的比较下，可以判断它们具有相同的基本骨架，因此可以将其鉴定为雪卡毒素的来源（Ciguatoxin、CTX）。由于采集到的菌株在培养中没有产生CTX，因此为了获得有毒菌株，笔者再次回到了法属波利尼西亚。虽然最终获得了有毒菌株，但期间一共花费了8年。G. toxicus分布虽然广泛，但是目前世界上已知的CTX生产菌株仅有少数，这给培养生产毒素造成了障碍。

覆盖在石灰藻上的G. toxicus

图1. 在石灰藻上密集生长的G. toxicus

b.化学结构

虽然大部分的鱼类都出现有毒现象，但处在食物链顶端的是海鳝。它的内脏会储存高浓度的CTX，因此最适于做为提取毒素的对象。由于个体差异和地域差异较大，花费了10年才收集到4吨的有毒个体。最终从124 kg内脏中获得了0.4 mg的CTX。然后利用NMR对化学结构进行了表征，如图2所示。CTX具有不同的CTX1B型和CTX3C型，两者有着不同基本骨架，双方都是在食物链传递过程中进行代谢性修饰。作为LC-MS定量用的标准品，研究人员使用qNMR定量了5种组分，但无法确保有足够的数量可以推向市场，所以根据需求提供给相关组织。此外，研究人员还通过LC-MS进行定量，成功检测出鱼肉中毒素含量为0.01 ppb这一严格的基准值。

平间正博东北大学名誉教授的团队已实现了全合成CTX1B和CTX3C的壮举。另外，大阪府立大学円谷健教授的团队，使用毒素分子两端的部分结构的合成产物制作了双抗体夹心法ELISA试剂盒。

c.作用

CTX与电压依赖性Na⁺ 通道结合，并抑制从去极化返回到极化的状态。CTX1B的化学结构如图2所示。其小鼠腹膜内给药的最小致死量（0.4 μg/kg）是河豚毒素最小致死量的25倍以上。推算口服摄入的最小发病量为人成人的7 ng。因其如此强烈的毒性，在鱼肉中的基准浓度被设定为0.01 ppb这样的极低值，检测上十分困难。

图2. 从海鳝中获得的主要成分CTX1B和G. toxicus 生产的CTX4B

d.刺尾鱼毒素

栉齿刺尾鱼是一种在珊瑚礁中常见的小型鱼，由于容易捕获以及烘烤时皮下脂肪很香，在大溪地非常受欢迎。同时，它也曾占了大溪地雪卡毒素中毒原因的60%以上。另外，它与肉食鱼双棘石斑鱼和海鳝相比，中毒症状较轻，这也是人们喜欢吃它的原因。以栉齿刺尾鱼为代表的食藻类鱼与食物链上端的鱼发现的中毒症状不同，一般被认为是是否是由于原因毒素的来源不同。笔者研究发现栉齿刺尾鱼胃肠道内容物含有除CTX毒素以外的其他高极性的毒素，因栉齿刺尾鱼的大溪地名称为“maito”，因此将该种毒素命名为“Maitotoxin、 MTX（刺尾鱼毒素）“。之后，成功地培养了含刺尾鱼毒素的G. toxicus，并将该毒素从藻类中分离出来，并表征了它的化学结构（图3）。作为不具有肽和多糖等单位结构重复的天然物，它是最大且最复杂的化合物。虽然其口服的毒性很弱，但其有着极强的毒性（小鼠腹膜内给药毒性，溶血活性），其真正中毒机理还尚未得以阐明。

图3. 刺尾鱼毒素的化学结构

东北大学名誉教授大泉康积极开展了MTX药理活性相关的初期研究。使用大鼠肾上腺皮质细胞（PC12细胞）和其他细胞进行实验，发现MTX可诱导细胞外Ca²⁺ 流入，并且在不存在Ca²⁺ 的情况下不显示活性。MTX没有离子载体活性，使用维拉帕米等Ca²⁺ 阻滞剂无法完全阻滞。由于也没有Na⁺ 通道的活性，因此被指出可能是通过未知的Ca²⁺ 通道进行活化的。

美国国立卫生研究院的已故John Daly博士及研究人员使用MTX对多种细胞系进行了实验，发现包含没有Ca²⁺ 通道的细胞在内，所有细胞系中都会有Ca²⁺ 流入的现象，这对阐明由Ca²⁺ 诱导引起的细胞现象非常有用。但是，随后MTX的供应中断以及Daly博士的逝世导致这项研究一直没有进展。此外，笔者等人培养的MTX生产菌株也在笔者退休后也死亡了。虽然最近有硫酸酯脱附制备MTX的报告，但目前仍未有MTX生产菌株。期望对发现特异性通道有用的化合物可以得以持续供应。

◆雪卡毒素派生的海洋毒素研究

a.河豚毒素（Tetrodotoxin）的细菌起源

河豚毒素（Tetrodotoxin，TTX）不仅是日本，还是世界上最著名的海洋毒素。多年来，研究人员一直认为河豚毒素是由河豚生产的，但是笔者在研究雪卡毒素时发现河豚毒素是来源于外部的。在调查大部分的珊瑚礁鱼关于CTX 和MTX的分布时，在并不是鲀科的热带鱼蓝纹神仙鱼和隆头鹦嘴鱼的内脏中发现了水溶性的急性毒。笔者注意到该急性毒以与河豚毒相类似的症状杀死了小鼠。之后，笔者使用自己制作TTX荧光分析装置进行分析，确认了其与TTX相一致。在东北大学的故乡宫城县产的河豚中，TTX含量也显示出明显的地域差异。此外河豚经常与TTX不同的麻痹性贝毒的石房蛤毒素（Saxitoxin、STX）共存，两种毒素的比例根据地域不同会出现较大的差异（图4）。由此可以推断，TTX和雪卡毒素的CTX相同地是通过食物链积蓄而来的，由此开始了寻找TTX起源的研究。

后来我们了解到发生雪卡毒素中毒的西南群岛和菲律宾的扇蟹类会积蓄TTX。分析其胃中出现的石灰藻后，确认了TTX的存在。但是TTX含量根据地域差和季节差会出现很大的差异，所以，毒素有可能是来源于石灰藻的粘附生物或细菌。通过分离和培养细菌后，确认了2种产生TTX的细菌。如果毒素来源是细菌的话，就能解释它在多种生物中移动和积蓄的现象。近年来，欧盟各国在养殖的双壳贝的消化道中检测到了TTX，并且还分离出产生TTX的细菌。虽然浓度很低，但TTX的存在仍然是食品卫生上的问题。由于检测和定量需要使用LC-MS，所以期望可以出现定量用的标准品。因为TTX的吸湿性很强，所以想要正确称量是十分困难的。当使用qNMR时， 需注意TTX是半乳糖型和10,7-内酯型的混合物，会提供两组信号，比例还会随pH和温度变化。另外，制备与TTX同时出现的同源物的鉴定用和定量用的标准品也是有一定意义的，但是想要实现是一项很难的课题。

图4. 河豚出现的TTX和STX的地域变化

b.沙海葵毒素类似物的发现和起源

沙海葵毒素（Palytoxin、PLTx、 C₁₂₉H₂₂₃N₃O₅₄）的结构是夏威夷大学D. Moore教授和名古屋大学故平田羲正以及上村大辅教授团队在竞争中阐明的，作为当时已知的最复杂且剧毒的化合物而备受关注。此外，在结构确定后不久岸義人教授发表的全合成也令人惊叹和赞赏。PLTx是基于夏威夷的剧毒海藻民间传说（实际上并不是海藻），在纽扣珊瑚中被发现的。据说只有在海岸约30 m的非常狭窄的礁石缝隙中生长的纽扣珊瑚才具有剧毒，并且其局部毒性变化幅度大表明了PLTx为外部起源。真正的产生者至今还没有得到证实。之后，包含笔者在内的大部分研究员从各种生物中检测出了PLTx和其类似物。

我们在G. toxicus 中发现了PLTx和雪卡毒素的相关性。G. toxicus 与大部分浮游生物不同，它附着在海藻表面生长，是一种的罕见的生态现象。在调查G. toxicus 的分布情况时，可以观察到大量附着在各种海藻上的沟鞭藻类。其中之一有毒藻Ostreopsissiamensis 的大小和形状与G. toxicus 非常相似。经过培养，将其含有的毒素命名为Ostreocin后，调查该毒素化学结构时意外地发现它是沙海葵毒素的类似物。虽然笔者也有期待过PLTx起源于沟鞭藻类，但是部分化学结构的甲基和羟基是不同的。后来，另一种类似的有毒藻Ostreopsisovata 在地中海繁殖，导致进行海水浴的游客的健康受到了危害。当发现了其产生的毒素积蓄在双壳贝类后，就被认为是公共卫生和食品卫生中的严重问题（该毒素被命名为Ovatoxin）。从化学结构的角度来看，Ostreocins和Ovatoxins具有不同的甲基和羟基，所以不是PLTx直接的前驱体。由于纽扣珊瑚中有细菌，蓝藻和沟鞭藻等多种微生物共存，也许是共生蓝藻产生的PLTx，但是海产蓝藻的培育非常困难，因此当下想要完全解决毒素起源的问题还是十分困难的。然而，在生化和药理学测试中经常会使用到PLTx，但是由于大量采摘有毒纽扣珊瑚和纯化PLTx非常困难，因此笔者十分担忧将来该毒素的供应。

c.腹泻性贝毒和冈田酸

1976年，日本东北沿海地区经常发生由双壳贝引起的腹泻，我们将引起腹泻症状的该毒素命名为腹泻性贝毒(Diarrhetic shellfish poisoning，DSP)。几乎同一时期，欧盟也发生多起相同的腹泻症状。在西班牙和法国成千上万的游客度假时在海岸边收到该毒素影响。现在，DSP是仅次于麻痹性贝毒的第二重要的贝毒。在纯化贝毒后，笔者初次看到其NMR光谱时，感到十分惊讶。它与冈田酸(Okadaic acid，OA)极为相似（图5），冈田酸是作为药理活性成分从海绵动物身上提取而出名的，是一种从大溪地的海底沟鞭藻类Prorocentrum lima 提取到的毒素。OA因可在缺少Ca²⁺的情况下引起平滑肌收缩而被关注。实际上，我们从贝壳分离出来的化合物是35-冈田酸甲酯（DTX1）。同时，我们还鉴定了一种名为Prorocentrolide的环状亚胺。有趣的是，在研究室惯例的暑假期间，笔者在三陆沿海的一家民宿住宿时，吃了水煮淡水贻贝作为啤酒的下酒菜时腹泻了。即使在怀疑有肠炎弧菌的污染下充分煮熟后还是腹泻了。因此我怀疑是化学物质的原因引起，将这次中毒命名为“腹泻性贝毒”（DSP），并将原因毒素命名为Dinophysistoxin，并对其进行了追踪。结果，鉴定出如图5所示的35-甲基冈田酸（DTX1）（图5）。将其命名为Dinophysistoxin-1（DTX1）的理由是由于确定了毒素的起源为沟鞭藻Dinophysis fortii（图6）。D. fortii 实际上不生产毒素，但会以微小的藻类为食，从而积蓄OA和DTX1。可培养的P. lima 会生产OA和DTX1两种成分，所以可以通过培养P. lima 生产 LC-MS定量用的标准品。总的来说，之前雪卡毒素研究与当下的三陆沿海的食物中毒事件相关性让笔者十分意外。

图5. 海底沟鞭藻生产的冈田酸

图6. 腹泻性贝毒的主要原因浮游生物D. fortii

◆结语

海洋毒素拥有很强的特异性，因此作为生化和药理学试剂或食品和公共卫生监测试剂非常重要。想要从毒鱼类和贝类提取原料十分困难，但最近随着各种分析手段的进步，如果可以像本文所描述的刺尾鱼毒素那样，即使是极少量的样品也能获得充分分析检测的话将是一件十分令人欣喜的事。

参考文献

1）Yasumoto, T. : Chemical Record, 1, 228 （2001）.

2）Yasumoto, T. : Proc. Japan Acad. Ser. B., 81, 43 （2005）.

3）Yasumoto, T., Nagai, H., Yasumura, T., Michishita, T., Endo, A. and Yotsu, M. : Ann. N.Y. Acad. Sci., 479, 44（1986）.

4）Takahashi, M., Ohizumi, Y. and Yasumoto, T. : J. Biol. Chem., 257, 7287 （1982）.

5）Gusovsky, F. and Daly, J. : Biochem. Pharmacol., 39, 1633 （1990）.

6）Yokoyama, A., Murata, M., Oshima, Y., Iwashita, T. and Yasumoto, T. : J. Biochem., 104, 184 （1988）.

7）上村大輔、平田義正：現代化学，145，14 （1983）.

8）Moore, R. E. : “Progress in the chemistry of Organic Natural Products .”, SpringerVerlag, Wien/New York, Vol. 48, p. 81 （1985）.

9）Usami, M., Ishibashi, S., Inoue, A., Kan, Y. and Yasumoto, T. : J. Am. Chem. Soc., 117, 5389 （1995）.

10）Yasumoto, T., Murata, M., Oshima, Y., Matsumoto, G. and Clardy, J. : “Seafood toxins, ACS Symposium eries.”, American Chemical Society, Washington, Vol. 262, p. 207 （1984）

◆海洋毒素相关产品

硅胶干燥剂在植物学研究中的应用

硅胶常用于各种样品的除湿和干燥。

在植物学实验中，可以使用硅胶对植物材料进行干燥处理，以进行后续的DNA分析。

在进行生态学、植物学野外调查时需要采集植物样本，但又常常缺乏低温或液氮速冻装置进行处理，可使用硅胶进行干燥。

如Chase^[1] 等人比较了从血草科和马鞭草科的新鲜植物叶和硅胶干燥样品中提取的总DNA，结果表示经硅胶干燥的植物样品中的DNA仍可保持完整。

图1

硅胶干燥与从新鲜叶片中用CTAB法提取的DNA样品，进行限制性内切酶消化前后的电泳比较（0.7% Agarose）。

结果表明6个物种的叶片，经过硅胶干燥后基因组DNA完整性仍较高，基因组里面的酶切位点依然保留从而可以被限制性内切酶酶切。

Chase, et al., 1991

图2

野外用硅胶干燥的叶片保存4-8周后，用CTAB法提取基因组DNA，进行限制性内切酶消化前后的电泳比较（0.7% Agarose）。

结果表明8个物种的叶片，经过硅胶干燥后在野外环境中保存一段时间，基因组DNA完整性仍较高，基因组里面的酶切位点依然保留从而可以被限制性内切酶酶切。

Chase, et al., 1991

◆应用示例

使用硅胶对植物样品进行干燥（适用于DNA 提取）：

1. 采集后应快速用灭菌水浸湿的无纺布或无尘纸将其表面的灰尘及泥土擦净后放入纸袋或无纺布袋中。

2. 应在容器中放一层干燥的变色硅胶后将已装入样本的分子材料袋放在变色硅胶上，再加入足量的硅胶至完全覆盖袋子。

3. 应每天检查变色硅胶颜色变化，更换变色硅胶直至其颜色不再发生明显变化

引用自团体标准T/SZAS 23—2020《植物组织材料采集与处理技术规范》

FUJIFILM Wako可提供蓝色和绿色两种变色硅胶，用于植物或其他样品的除湿和干燥。其中蓝色硅胶以氯化钴作为指示剂，绿色硅胶则使用不含钴的有机染料作为指示剂。

图3. 硅胶不同颜色对应的不同相对湿度

◆产品列表

硅胶（蓝色）

含有氯化钴的变色硅胶。吸收水分后，硅胶的颜色会从蓝色变为粉红

硅胶（绿色）

不含氯化钴的变色硅胶，可放心使用。吸收水分后，硅胶的颜色会从绿色变为粉红色再变为橙色。

◆参考文献

脂质研究用 产品特辑

脂质是脂肪酸与甘油酯结合的甘油三酸酯等甘油脂、神经酰胺等鞘脂，以及包括以胆固醇为代表的甾醇等多种分子的总称。它的功能除了组成细胞与外界隔离的细胞膜、发挥储存能量的作用之外，还作为信号传播通路的第二信使发挥作用参与细胞内的现象。

1. 细胞膜、细胞内的膜相态的观察（LipiORDER）

2. 脂肪酸β氧化的观察（FAOblue）

3. 脂质自由基的检测与抑制剂（LipiRADICAL/OH-Pen）

4. 脂滴的观察（LipiDye II）

◆脂质研究相关 产品列表

◆关于细胞膜与磷脂

细胞膜及脂质双分子层主要由磷脂构成，磷脂具有亲水性的头部以及疏水性的尾部。它的结构含有1个胆碱基、磷酸基团及甘油二酸酯或鞘氨醇的其中之一。在脂质双分子层中，亲水性的头部向细胞质或细胞外基质一侧突出，而疏水性的尾部互相朝向膜内侧（Singer, S. J., et al., Science., 175, 720, 1972）。有报告称，磷脂除了这种脂质双分子层结构的成分之外，也是生物学上与信号传播密切相关的重要分子。例如，血小板活化因子（PAF：Platelet-Activating Factor），它作为血小板的凝集和炎症的介质而为人所知，同时也是磷脂的一种（Prescott, S. M., et al., Annu Rev Biochem. 69, 419, 2000）。此外，膜的主要组成成分——磷脂酰肌醇，会被磷脂酰肌醇激酶（PI3K：Phosphatidylinositol 3-kinase，Phosphoinositide 3-kinase）磷酸化，作为信号传播通路的第二信使发挥作用（Cantrell, D. A., et al., J Cell Sci., 114, 1439, 2001）。

◆关于生物膜的相态（Lipid order）

构成生物膜的脂质种类繁多，膜的状态因其脂质的组成而大不相同。例如，仅由饱和脂肪酸组成的脂质膜因密度高且包裹坚固，被称为有序相（Lo）；由含有不饱和脂肪酸的脂质组成的脂质膜因密度低，被称为无序相（Ld）。像这样的脂质微环境被称为相态（Lipid order)。在简单模型中，Lo和Ld分离并发生明确地相分离（如下图），但由于细胞生物膜中的脂质种类繁多，不会发生图中模型所示的简单相分离，而是发生反映总和性质的相态。

另外，相态被认为会受到膜蛋白存在的影响，而实际细胞膜上的相态更为复杂。细胞膜上的Lo有时也被称为脂筏（Lipid raft），作为生物膜的功能域备受关注。这种脂质膜相态的观察对于理解生物膜流动性和坚固性等膜的生物物理学性质非常重要，期待未来能开发出针对它的分析方法。

生物膜的相态

◆关于脂质代谢

脂肪酸是组成细胞各种脂质的基本要素，与葡萄糖、氨基酸并称为能源。尤其是在葡萄糖不足而饥饿的时候，脂肪酸会积极分解，产生大量ATP。虽然脂肪酸根据碳链的长短以及不饱和度的差别存在不同的种类，但它在线粒体等的分解路径相同，因此被称为脂肪酸β氧化（Fatty acid beta-oxidation; FAO）。

脂肪酸β氧化主要通过4阶段的酶反应梯度分解路径——（1）脂肪酸β位的氧化，（2）β位的水合，（3）β位的氧化，（4）裂解，被分解为2个碳原子的短链脂肪酸和作为ATP原料的乙酰CoA。其中生成的2个碳原子的短链脂肪酸通过同一个循环，重复分解成2ⁿ 个碳原子的短链脂肪酸。研究提出，癌症以及非酒精性脂肪肝（NASH）等疾病中，脂肪酸β氧化会出现很大的变动，因此开发检测脂肪酸β氧化活性的方法备受期待。

脂肪酸β氧化（Fatty acid beta-oxidation：FAO）

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◆关于脂质过氧化

脂质过氧化反应（lipid peroxidation； LPO）是指由于氧化应激引起的脂质被氧化分解的反应，是脂质的分解过程之一。脂质过氧化反应是生物中确立了细胞伤害的机制，被用作细胞及组织中氧化应激的指标。

过氧化脂质不稳定，分解后形成含活性羰基化合物的一系列复杂的化合物。多不饱和脂肪酸过氧化物在分解时会产生丙二醛（MDA）和4-羟基肾上腺素（HAE），已知是由于这些下游活性物质引起的ER应激、细胞毒性和铁死亡诱导等各种影响。这些MDA及HAE的检测被用作脂质过氧化的指标（Esterbauer, H., et al., Free Rad. Biol. Med., 11, 81, 1991）。但由于特异性不充分会产生各种下游因子，因此正在寻求一种检测更上游的因子的检测方法。

脂质过氧化反应（LPO）与脂质自由基（Lipid radical）

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◆关于脂滴

脂滴（Lipid droplet）存在于所有的真核生物中，中性脂质主要作为三酰基甘油和胆固醇酯的容器发挥作用。由于储藏的脂质是用于能量、类固醇合成或膜形成的，因此脂滴的积存是细胞的正常功能。虽然脂肪细胞中含有大量的脂滴，但细胞内积存的脂滴过多，会成为代谢缺陷或病因的指标。例如，肝脏细胞（脂肪症）中脂质的过多积存会造成细胞功能不全。动脉粥样硬化在发病时，巨噬细胞会吞噬氧化LDL，并发展成泡沫细胞，造成动脉狭窄。近年来逐渐明确了脂滴与脂肪细胞无关，可在肝细胞、平滑肌细胞、胶质细胞等各种细胞中发现，不仅具有以前认为的作为中性脂质的储藏器官的作用，还有控制代谢或调节基因表达等各种功能。对各种细胞中的脂滴进行观察发现，非脂肪细胞的脂滴小于1 μm，与脂肪细胞的10~100 μm相比，是非常小的。虽然未来利用成像检测活细胞中非脂肪细胞的微小脂滴的试剂备受期待，但目前Nile Red等现有试剂可以看见脂滴以外的染色（S/N比率低），存在不适用于活细胞成像等的问题，观察微小脂滴仅限于电子显微镜观察。

脂滴的模式图（左图）及使用LipiDye II对脂肪细胞、非脂肪细胞的脂滴进行染色的图像（右图）

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◆脂质研究用产品列表

B细胞研究试剂

◆高灵敏B淋巴细胞活化因子（BAFF）检测试剂盒

◆Sandy-2 -独一无二的新型小鼠BAFF封闭抗体

◆B细胞耗竭小鼠BAFF-R抗体

◆高活性BAFF 60-mer蛋白多聚体

所有BAFF受体，BAFF-RTACIBCMA激活剂！

◆B细胞激活剂

Highly Active Human, Mouse & Rat Multimeric CD40L

高活性人小鼠大鼠CD40L蛋白多聚体

◆浆细胞阻断抗体

◆B细胞增殖诱导剂

Highly Active Human & Mouse WT and Mutant Multimeric APRIL

糖链研究试剂

糖链几乎存在于人所有细胞和蛋白的表面，通过赋予它们某些生物学功能来发挥作用。在癌症、免疫、发育/分化、再生医疗和传染病等各种领域都报告了它的重要性。

FUJIFILM Wako现提供销售生物制药的过程用酶、各种凝集素、抗糖链抗体等糖链研究和分析的工具。

◆产品总览

◆什么是糖链？

糖链，是糖类通过糖苷键连接成链状的分子，仅次于核酸和蛋白，被称为“第三条大分子生命链”。由于糖链的结合位点众多，可以形成比核酸和蛋白更多样化的结构。

生物体内的糖链主要与蛋白和脂质结合，分别被称为糖蛋白和糖脂，各自的特点如下：

▼糖蛋白

大部分的蛋白是带有糖链的糖蛋白，尤其是膜蛋白和血清中的大多数蛋白。另外，结合1条以上长多糖链（糖胺聚糖）的蛋白称为蛋白聚糖。

糖蛋白的糖链主要通过2种结合模式（N-结合型/O-结合型）与蛋白结合。被称为N-结合型（Asn型）的结合模式是在Asn-X-Ser/Thr序列的Asn残基上N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）与N-β-糖苷结合而成，除GlcNAc外，组成成分还有半乳糖、岩藻糖、甘露糖、唾液酸等，但几乎没有观察到在后面提及的O-结合型中发现的GalNAc。另外，O-结合型（粘蛋白型）是在Ser或Thr上的N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）与O-α-糖苷结合而成，除GalNAc外，组成成分还有半乳糖、岩藻糖、唾液酸等，但通常无法观察到N-结合型组成糖类的甘露糖。

众所周知，糖蛋白上的糖链会影响蛋白的物理性质（溶解性、电荷、稳定性、粘性、高阶结构、抗冻结性、分解耐性、抗原性的隐藏）。

▼糖脂

组成真核生物细胞膜的脂质多数是结合了糖链的糖脂。糖脂大致可分为鞘脂和甘油糖脂。鞘脂由鞘氨醇和脂肪酸结合形成的脂质神经酰和糖链结合而成，甘油糖脂由在甘油骨架中与脂肪酸结合的1,2甘油二酯和糖链结合而成。

细胞膜上的糖脂与上述的糖蛋白和蛋白聚糖一起包裹着细胞。细胞表面上的糖链可根据细胞的各种类型，用于识别细胞。另外还阐明了糖脂本身具有多种活性，有报告称可以通过控制蛋白的活性来调节细胞的分化诱导和细胞增殖等。

◆糖链是“细胞的面孔”

真核生物的细胞被糖链覆盖，其组成因细胞的种类和性质差异而不同，因此糖链被称为“细胞的面孔”。

实际上，生物利用糖链来认识和识别细胞。例如，精子利用存在于卵子表面的糖蛋白来识别卵子和不是卵子的细胞。此外，当感染病原体时，内皮细胞通过在细胞膜表面表达凝集素，识别中性粒细胞表面的糖链。因此被选中的中性粒细胞游离至感染部位。而且还进一步揭示了分化细胞（体细胞）和未分化细胞（ES细胞、iPS细胞）中细胞表面的糖链明显的结构差异。

另外，糖链也存在个体差异，其典型代表就是血型。ABO式血型是根据红细胞表面出现的糖链结构的不同来定义的。血型不同的人之间进行器官移植时，会因细胞的表面不同而产生排斥反应。

细胞表面上的糖链，与病原体和癌症密切相关。例如，存在于流感病毒膜表面的血凝素与细胞表面的糖链（唾液酸）结合，入侵至细胞内。另有报告称，癌细胞的糖链结构与正常细胞不同，由于癌化而增大的特定的糖链结构会提高癌症的转移能力。

通过利用作为细胞面孔的糖链，可能可以检测和去除特定的细胞，识别特定糖链的抗糖链抗体和凝集素的研发也在进行中。

参考文献

糖鎖工学編集委員会：「糖鎖工学」 (産業調査会) (1992).
ブルース・アルバーツ、中村桂子 松原謙一 監訳：「Essential細胞生物学 (原書第2版)」 (南江堂) (2005).
成松久：Synthesiology, 5(3), 190 (2012).