外泌体与生命现象——第六回 外泌体与病毒

东海大学综合医学研究所造血肿瘤领域 东海大学医学部血液·肿瘤内科 柿崎正敏、幸谷愛

◆前言

病毒感染有史以来就已经存在，但直到1898年口蹄疫病毒的发现，病毒才被定义为病原体。与人类疾病相关的病毒就有数百种，从日常生活中经常会遇到的呼吸道、消化道等急性感染病，到艾滋病、乙型肝炎和宫颈癌等慢性疾病都与各种病毒感染有关。近年来，有报道称，细胞外囊泡（Extracellular vesicles: EVs）中的外泌体与病毒的生存策略具有相关性。

本文将介绍病毒感染细胞释放出的外泌体与病毒性疾病的相关研究，然后进一步概述作者研究的B型肝炎病毒（Hepatitis B virus: HBV）感染细胞来源外泌体的功能。

 

◆外泌体的分泌

外泌体来源于向晚期内体中的多囊泡体（Multi vesicular body: MVB）出芽的腔内囊泡（intraluminal vesicles: ILVs），是约100 μm大小的囊泡^1）。ILVs的形成与被称为ESCRT（endosomal sorting complex required for transport）的蛋白质复合物有关。MVB与细胞膜融合后，外泌体被分泌到细胞外。

 

◆病毒的出芽

病毒有几种出芽的途径，包括从细胞膜中直接出芽及通过MVB出芽等。有报道称，逆转录病毒、黄病毒、弹状病毒和副粘病毒等具有多层包膜的RNA病毒，可以通过ESCRT复合物和ESCRT相关蛋白的相互作用促进病毒从细胞膜中出芽^2）。另外，HBV及E型肝炎病毒（Hepatitis E virus: HEV）也能与ESCRT复合物及ESCRT相关蛋白相互作用，然后通过MVB途径释放而出^2,3）。综上，病毒会通过劫持ESCRT机制，来使自身顺利出芽。

 

◆病毒感染细胞来源外泌体的功能

除出芽之外，病毒还会劫持ESCRT机制向外泌体中输送病毒基因组和病毒相关蛋白，因此，外泌体有利于病毒的存活。实际上，HIV感染细胞来源的外泌体中，含有一种HIV病毒蛋白Nef，吸收了含有Nef的外泌体的细胞更容易感染HIV^4,5）。另外，EBV阳性B细胞淋巴瘤来源的外泌体中含有EBV编码的miRNA，吸收了该外泌体的巨噬细胞会发生肿瘤相关的巨噬细胞样的特性改变，并且会促进肿瘤细胞的生长^6）。

如上所述，迄今为止，有关各种病毒感染细胞来源的外泌体的功能分析一直在进行。下文将概述作者正在研究的HBV感染细胞来源的外泌体的功能。

 

◆HBV

HBV是世界范围内的传染病，全球估计有4亿持续性HBV感染患者，大部分集中在亚洲和非洲，而日本估计也有大约

100万HBV携带者。在日本，防止母婴传染的措施减少了新的感染，病毒复制逐渐能被核酸类似物控制，但仍未发现能完

全清除病毒的疗法。为了开发能完全消除HBV的治疗方法，首先需要明确B型肝炎变成慢性病的过程，然而，B型肝炎向

慢性病发展的过程中仍存在很多不清楚的部分。近年来，在慢性B型肝炎患者的血液中的单核细胞中，PD-L1的表达增

加^7），尤其是HBV特异性CD8阳性T细胞中的PD-L1的表达，细胞毒性显著下降^8）。  因此，PD-1/PD-L1-axis有可能是慢性B型肝炎致病原因之一。对此，作者假设含有HBV感染细胞释放出的外泌体的EVs参与了B型肝炎发展成慢性B型肝炎的过程，并对此进行了研究。

 

◆HBV感染细胞来源EVs的功能

除外泌体外，HBV感染细胞还会释放大量仅含有HBs抗原的非感染性中空颗粒。这些中空颗粒具有HBs抗体诱饵的作用，但实际功能仍未明确。本文记述了含有外泌体、中空颗粒和HBV病毒颗粒的EVs。为了找出HBV感染细胞来源的EVs被何种细胞吸收，作者先向人末梢血单核细胞（Peripheral blood mononuclear cells:PBMCs）的培养上清中投放荧光标记的HBV感染细胞来源的EVs，24小时后再用FACS进行分析。结果，单核细胞会选择性地吸收EVs（图1A）。在吸收了EVs的单核细胞中，PD-L1的表达增加（图1A），免疫细胞的活性标记物CD69的表达减少。接下来，为了鉴定与PD-L1 和CD69表达增减相关的颗粒，作者利用密度梯度离心法分离外泌体、中空颗粒和HBV病毒颗粒，然后将各种颗粒分别投放到PBMC培养上清中，24小时后确认PD-L1的表达。结果发现，所有颗粒中的PD-L1表达增加，CD69表达减少，特别是外泌体和中空颗粒会使PD-L1表达增加（图1B），CD69表达减少。据以上所述，HBV感染细胞来源的外泌体与中空颗粒可能对吸收的单核细胞具有免疫抑制能力^9）。

图1

 

其次，为了调查HBV感染细胞来源EVs是否也会在体内诱导免疫抑制，作者使用HBV感染的小鼠模型进行了研究。为了在小鼠体内获得肝炎实验体系，在用HBs抗原免疫了三次的小鼠中，使用Hydrodynamic injection（HDI）法将野生型HBV复制子质粒转染到肝脏中。由此能获得HBV肝炎模型。进行HDI的2小时后，从尾静脉处注射HBV感染细胞来源的EVs，3天后再检查肝脏中的细胞浸润和HBc抗原表达。结果发现，在未注射HBV感染细胞来源的EVs的小鼠肝脏中能观察到大量的细胞浸润，而且几乎无法确认HBc 抗原（图2）。另一方面，注射了HBV感染细胞来源EVs的小鼠肝脏几乎没有细胞浸润，并且能观察到许多HBc抗原（图2）。上述结果表明，HBV感染细胞来源EVs会诱导体内免疫抑制。

图2

 

◆结语

在外泌体发现初期，其被认为是细胞释放出无用的蛋白质和核酸的机制。但如今，外泌体作为细胞间通信器，和各种疾病的诊断和治疗的目标而受到关注。在本文中，作者介绍了一些与病毒感染细胞来源外泌体功能相关的研究，研究表明外泌体参与了所有生命现象。许多研究都阐明了外泌体的生物学意义，但是关于其作用机制和产生过程的细节仍有许多不明确的部分。期待作者的研究能有助于未来的外泌体研究。

 

〔参考文献〕

1） Murk, J. L. et al . : Semin. Cell Dev. Biol ., 13（4）, 303（ 2002）.

2） Selzer, L. and Zlotnick, A. : Cold SpringHarb. Perspect. Med ., 5（ 12）, 0021394（ 2015）.

3） Nagashima, S. et al . : J. Gen. Virol ., 95, 2166（2014）.

4） Campbell, T. D. et al . : Ethn. Dis ., 18（ 2 Suppl 2）, S2-14（ 2008）.

5） Arenaccio, C. et al . : J. Virol ., 88, 11529（ 2014）.

6） Higuchi, H. et al . : Blood , 131 （23）, 2552（2018）.

7） Huang, Z. Y. et al . : Viral Immunol ., 30 （3）,224（ 2017）.

8） Boni, C. et al . : J. Virol ., 81, 4215（ 2007）.

9） Kakizaki, M. et al . : PLoS One , 13 （12）,e0205886（ 2018）.

 

◆外泌体相关试剂盒

产品编号	产品名称	规格	包装
299-77603	MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS MagCapture™外泌体提取试剂盒PS	基因研究用	2 tests
293-77601			10 tests
298-80601	PS Capture™ Exosome ELISA Kit (Streptavidin HRP) PS Capture™外泌体ELISA试剂盒（链霉亲和素HRP）	基因研究用	96 tests

第六回 小胶质细胞-星形胶质细胞相互关联控制脑卒中

小胶质细胞研究的前沿  —从基础到临床—

山梨大学大学院　综合研究部　医学域　药理学讲座　小泉修一

◆前言

如今，胶质细胞在大脑功能中发挥的作用被不断地阐明。尤其是在各种大脑疾病中，胶质细胞的变化迅速、大且多样，因此研究人员认为这些胶质细胞的变化在大脑的异常和修复过程中可能发挥了重要的作用。这些假设逐渐被认可的同时，仍残留了许多课题。例如，胶质细胞研究在体外和体内实验的研究结果差异大，目前在体外实验获得的研究结果无法直接运用至体内实验研究。

此外，至今为止的大部分研究，都将各类胶质细胞分为小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞等分别进行研究，忽略了大脑功能受异源胶质细胞间交流结果的控制。当然，胶质细胞研究的历史和经验尚浅，先阐明各类胶质细胞的性质十分重要，而近期的研究以各类形式提出，胶质细胞可能作为集结者，通过异源胶质细胞间的协作控制大脑功能。

本文着眼于体内脑卒中模型中小胶质细胞-星形胶质细胞的关联，阐述其交流在控制大脑功能时发挥作用的重要性。

◆小胶质细胞-星形胶质细胞的关联

小胶质细胞对大脑内外环境的变化非常敏感，能够感知细微的变化，并先于大脑做出变化。例如，小胶质细胞在中年期就已活化并开始衰老^1），而在肌萎缩侧索硬化等神经退行性疾病中，它们在发病前就已活化并与疾病的发病机制和难以治疗相关^2）。虽然活化的小胶质细胞可以直接控制神经细胞的功能，但通过作用于星形胶质细胞能影响大脑功能。在外伤性脑损伤模型中，小胶质细胞首先感知到损伤并传达给星形胶质细胞，从而发挥保护作用^3），另外感知到炎症的小胶质细胞通过传达信息给星形胶质细胞来控制神经细胞的功能^4）。

若先经历过非侵袭性缺血应激，在后来的侵袭性缺血时便可获得抗性，这种现象称为“缺血耐受性”，在实验和临床上比较常见（图A，B）。在短暂性大脑中动脉闭塞（MCAO）模型小鼠中，首先发生强烈变化的细胞是小胶质细胞，其次是星形胶质细胞^5）。即使是不会造成显著伤害的非侵袭性MCAO（预处理，PC），灵敏的小胶质细胞仍会活化。

另外，非侵袭性MCAO以外的PC也能够诱导缺血耐受性，出现交叉缺血耐受性现象，但诱导交叉缺血耐受性的典型代表PC是革兰氏阴性细菌细胞壁成分的lipopolysaccharide（LPS，脂多糖）。LPS在中枢对小胶质细胞Toll样受体4的作用特别强，表明小胶质细胞对于缺血耐受性诱导来说至关重要。

这些小胶质细胞性缺血耐受性的诱导机制与Ⅰ型干扰素介导的通路密切相关，其他小胶质细胞依赖性神经胶质递质、细胞因子、神经营养因子等也非常重要。因此，小胶质细胞不仅能够直接作用于神经细胞，还通过作用于星形胶质细胞等其他类型的胶质细胞，间接诱导缺血耐受性的机制，近年有人提出了后者的重要性。

图. 通过胶质细胞交流获得缺血耐受性的机制

A. 侵袭性脑缺血导致的神经细胞严重损伤或死亡。

B. 经历非侵袭性缺血（PC）后，诱导其在侵袭性缺血时获得抗性的缺血耐受性。

C. PC类的轻度刺激由小胶质细胞先感知。小胶质细胞转化为活性小胶质细胞，直接参与缺血耐受性诱导，同时诱导星形胶质细胞活化（反应性星形胶质细胞）。反应性星形胶质细胞通过多种机制促进缺血耐受性的形成，特别是通过P2X7受体表达和P2X7受体依赖性HIF1α表达介导的神经保护机制，缺血耐受性持久且强效。

◆从小胶质细胞到星形胶质细胞的信号传递

感知到PC后的小胶质细胞如何把信号传达给星形胶质细胞呢？一般有多种DAMP，而ATP作为最初的信号尤为重要。ATP/P2受体信号的显著变化是脑卒中初期及LPS负荷小胶质细胞最初的应答变化。

感知到LPS后的小胶质细胞通过表达囊泡核苷酸转运蛋白（Vesicular nucleotide transporter），增强ATP的胞吐作用^6）。感知到脑卒中后的小胶质细胞会表达一般情况下不表达的P2Y1受体，并结合ATP，使小胶质细胞自身的功能发生巨大变化^7）。尤其是ATP，即使在脑卒中以外，在受到高度的兴奋性刺激时^4）,在外伤性脑损伤^3）等的初期应答中，作为从小胶质细胞到星形胶质细胞的信号起着核心作用。小胶质细胞自身也有保护大脑的作用^7），第一时间感知到更敏感的小胶质细胞信息，并将该信息传达给大脑保护功能更强大的星形胶质细胞，通过这种级联反应，发挥作为各脑部疾病安全装置的作用。

◆作为缺血耐受性执行细胞的星形胶质细胞

PC可使星形胶质细胞活化（反应性星形胶质细胞）。抑制该功能就会使缺血耐受性消失，因此可以说反应性星形胶质细胞是诱导缺血耐受性的必要条件。反应性星形胶质细胞是缺血耐受性诱导的执行细胞，其自身直接或通过与神经细胞和其他细胞的交流间接地在缺血耐受性诱导中发挥核心作用。

例如，反应性星形胶质细胞具有产生神经保护分子、增强兴奋性神经递质和去除有毒物质的功能、调节能量代谢等多种作用，特别是通过P2X7受体介导的作用更强^5，8，9）。通过PC，反应性星形胶质细胞通过星形胶质细胞特异性大量（100倍以上）且长期（8周以上）地使P2X7受体的表达增强，并以受体依赖性诱导缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor1α，HIF1α），发挥强烈的缺血抵抗性（图C）。

包括这种星形胶质细胞特异性的P2X7受体表达增强机制在内，缺血耐受性型星形胶质细胞的诱导机制还有很多尚不明确的地方。如上所述，由于小胶质细胞在PC诱导反应性星形胶质细胞之前活化，因此认为是小胶质细胞诱导了缺血耐受性型星形胶质细胞。然而这种推测是否正确，有关小胶质细胞诱导的星形胶质细胞表型多样性等相关问题，仍有许多不明之处，有待今后进一步研究。

此外，小胶质细胞如何感知非侵袭性的温和PC？又会产生怎样的表现型？小胶质细胞向星形胶质细胞和神经细胞传达的信号分别又是什么？等等一系列的问题尚待解决。但是，小胶质细胞-星形胶质细胞如同继电器一样传达大脑环境内的变化，并以此改变其在大脑中的应答性机制，被认为是各种脑部疾病发病前的常见现象。揭示了这是一种溢出效应较大的现象，期待未来的研究进展。

◆结语

本文以缺血耐受性为例，表明了小胶质细胞在控制神经胶质细胞脑功能方面的重要性。虽然小胶质细胞和星形胶质细胞均具有诱导缺血耐受性的潜力，但事实上小胶质细胞-星形胶质细胞关联的相互作用很可能发挥更重要的作用。随着各类胶质细胞的研究日渐活跃，预计未来异源细胞间相互作用控制神经细胞的观点也会越来越重要。

◆参考文献

1）Zhang, G. et al. : Nature, 497, 211 (2013). DOI: 10.1038/nature12143

2）Sanagi, T. et al. : J. Neurosci. Res., 88, 2736 (2010). DOI: 10.1002/jnr.22424

3）Shinozaki, Y. et al. : Cell Rep., 19, 1151 (2017). DOI: 10.1016/j.celrep.2017.04.047

4）Pascual, O. et al. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109, E197 (2012). DOI: 10.1073/pnas.1111098109

5）Hirayama, Y. et al. : J. Neurosci., 35, 3794 (2015). DOI: 10.1523/JNEUROSCI.4218-14.2015

6）Imura, Y. et al. : Glia, 61, 1320 (2013). DOI: 10.1002/glia.22517

7）Fukumoto, Y. et al. : J. Cereb. Blood Flow Metab., 39, 2144 (2019). doi: 10.1177/0271678X18805317

8）Hirayama, Y. and Koizumi, S. : Glia, 65, 523 (2017). DOI: 10.1002/glia.23109

9）Hirayama, Y. and Koizumi, S. : Neurosci. Res., 126, 53 (2018). DOI: 10.1016/j.neures.2017.11.013

““小胶质细胞研究的前沿—从基础到临床—”系列：结语 九州大学大学院　药学研究院　药理学领域　津田诚     从和光纯药时报2020年第3期开始连载的“小胶质细胞研究的前沿-从基础到临床-”系列共6篇，最终以综述“小胶质细胞-星形胶质细胞连     锁调控脑卒中”作为完结篇。本系列对阿尔茨海默病、癫痫、脑梗塞、精神疾病、慢性疼痛等小胶质细胞发挥重要作用的疾病进行了探讨，     以简明易 懂的方式介绍了其近期的新发现和前景，并毫无保留地讲述了小胶质细胞的魅力。衷心感谢引领世界小胶质细胞研究的各位老师     们，在百忙之中为本系列文章执笔，同时由衷期待有朝一日能够阐明目前小胶质细胞研究结果尚无法克服的神经疾病的发病机制，并实现诊     断和治疗方法的开发。

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