新型亲和性外泌体纯化法与外泌体高灵敏度检测应用

◆前言

　　外泌体是各种细胞外泌的直径在30-100nm之间的膜囊泡。因外泌体内含mRNA、microRNA等核酸和蛋白质对相邻细胞具有交换信息的功能。作为细胞间信号传导的通讯工具和作为癌等各种疾病的生物标记话题比较热议^[1][2]。因此，这几年各领域关于外泌体研究很广泛，但是在现实的外泌体实验技术的发展中，关于需要改进的课题存在很多。例如，在外泌体纯化方法中超离心分离法和多聚体沉淀法（市售试剂盒），容易混入多种杂质，在后续实验中增加了很多障碍。另一方面，抗体亲和性和密度梯度离心可获得高纯度外泌体，但是不能获得完整状态。因此存在着不能分析外泌体完整状态下的生理功能。作为外泌体进一步检测方法，免疫印迹和ELISA被广泛应用。但是存在着需要大量外泌体样本和标记蛋白量少导致检测较困难的问题。

　　因此本文为了解决外泌体实验技术中各种课题，我们关于开发的新型外泌体分析工具进行了说明。

◆磷脂酰丝氨酸亲和性新型外泌体纯化法

　　外泌体膜虽然含有分泌细胞源蛋白质和脂质，但众所周知磷脂酰丝氨酸（PS）在活细胞通过翻转酶作用导向细胞膜内侧，也会暴露在外泌体膜外侧^[3]。另外，被作为通过巨噬细胞进行细胞凋亡的吞噬受体T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 4(Tim4)蛋白质通过细胞外域IgV域与含有钙离子的PS结合^[4]。以上述知识为参考，我们利用Tim4固化磁珠，在钙离子存在下捕捉培养上清和血清等样品中的外泌体，再添加螯合剂可纯化外泌体，这种划时代外泌体纯化方法是和金泽大学医学系免疫学华山教授共同开发，并取得了成功。^[5]并且MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS实现了比以前的外泌体纯化法更加简捷地纯化高纯度完整状态的外泌体。这是迄今为止取代黄金标准超速离心法的新型外泌体纯化法。（图1）

◆PS Capture™ Exosome ELISA Kit的特点和使用案例

　　PS Capture™ Exosome ELISA Kit是Tim4蛋白通过PS和外泌体亲和性结合的应用ELISA试剂盒。本试剂盒将外泌体表面标记蛋白的抗体固相化，相比以前的ELISA法，可高灵敏度检测外泌体。此方法是将培养上清和血清等含有外泌体的样本添加到Tim4蛋白包被的干板，在钙离子存在下捕获外泌体，通过对外泌体表面标记蛋白质进行一抗结合反应和二抗结合反应，从而完成对外泌体检测（图2）。此外，本试剂盒附加了可作为一抗的小鼠抗CD63单抗，但除此之外，如果测定外泌体表面标记的话，需提前准备小鼠源一抗方可检测外泌体。

　　本试剂盒的优点就是实现了比免疫印迹和已有的Exosome ELISA产品更高灵敏度检测外泌体。首先，为了用本试剂盒和免疫印迹法比较检测灵敏度，在免疫印迹实验中需要检查外泌体检测极限值（图3a）。结果显示，以人结肠癌细胞的COLO201细胞源纯化外泌体作为样本通过抗CD63单抗进行免疫印迹实验，检测出蛋白质含量75ng的外泌体。然后，用本试剂盒检测纯化的白血病源细胞株K562细胞以及COLO201细胞源外泌体的ELISA检测极限值，K562细胞源外泌体的检测极限值为49.9pg，COLO201细胞源外泌体检测极限值为10.9pg。免疫印迹实验实际具有1000倍以上的检测灵敏度（图3b）。另外，已有Exosome ELISA产品的灵敏度在数ng~µg之间（参考各产品手册），但是本试剂盒通过PS与Tim4蛋白亲和性结合比原来外泌体表面标记抗体包被ELISA法在灵敏度上高出100倍以上。

　　最后，本试剂盒的使用案例为各种细胞源外泌体表面标记蛋白的表达分析。用13种细胞培养上清纯化的外泌体各1ng，通过外泌体标记蛋白CD9/CD63/CD81的抗体进行ELISA检测（图4）。结果显示，在各外泌体中表面标记蛋白的存在比例因来源细胞不同而存在明显差异。有的细胞株分泌不具有特定标记蛋白的外泌体，外泌体异质性高且明显的数据说明本试剂盒的ELISA系统是十分优质的。

◆结论

　　综上所述，利用Tim4蛋白的PS亲和性原理的MagCapture^™ Exosome Isolation Kit PS实现了可简便高灵敏度纯化外泌体。PS Capture^™ Exosome ELISA Kit是高灵敏度检测外泌体的划时代产品。为此，通过使用本试剂盒对原方法混入杂质后外泌体标记蛋白确认分类问题和至今为止免疫印迹实验以及已有Exosome ELISA产品微量表面标记蛋白检测困难等问题都可解决。今后本公司将会利用Tim4蛋白的PS亲和性能开发外泌体研究相关试剂。真诚希望这些产品为外泌体研究发展做出贡献。

参考文献

[1] Tkach, M. et al. : Cell, 164, 1226 （2016）.

[2] Raimondo, F. et al. : Proteomics,11, 709 （2011）.

[3] Trajkovic, K. et al. : Science,319 （5867）, 1244 （2008）.

[4] Miyanishi, M. et al. : Nature, 450, 435 （2007）.

[5] Nakai, W. et al. : Sci. Rep., 6, 33935 （2016）.

◆相关产品

1.　Exosome外泌体试剂盒

2.　PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒（抗小鼠IgG POD）

外泌体与肿瘤细胞转移及恶化的关联

东海大学综合医学研究所造血领域 东海大学医学部血液肿瘤内科 樋口广士、幸谷爱

◆前言

　　肿瘤的形成和恶化过程不仅与肿瘤细胞彼此间的相互作用有关，还和肿瘤细胞和正常细胞所构成微环境的相互作用有关。例如，从很早开始科学家们就观察，在很多的肿瘤组织中浸润着正常的免疫细胞，而临床认为慢性炎症会增加产生肿瘤的风险。此外，有报告显示成纤维细胞和内皮细胞等细胞构成的肿瘤微环境，有助于肿瘤细胞的增殖。

　　大多数以根治肿瘤细胞为目标的治疗方法，不仅对正常细胞有很强的毒性，其副作用还会对身体产生极大的负担。而且，由于染色体不稳定的肿瘤细胞容易获得耐药性，病情反复发作时药物无效也是一个很大的问题。对此，破坏由正常细胞构成的微环境又或者对其进行适当的控制来根治肿瘤的治疗策略备受瞩目^1）。

　　本文对细胞外泌体和肿瘤细胞转移及其恶化的关联进行了介绍，同时也对Epstein-Barr病毒（EBV）阳性恶性淋巴瘤中外泌体的活动情况进行了概述。

◆细胞外囊泡外泌体是什么？

　　生物体内所有的细胞都是通过直接接触或者细胞因子、趋化因子等分泌蛋白来进行信息传递的。近年来，作为担任这种细胞间信息传递的新因子，细胞外囊泡受到了大家的关注。科学家发现，细胞外囊泡和细胞一样，由脂质双层膜构成，包含蛋白，核酸、脂质等多种物质，同时细胞外囊泡还能传递这些分子中包含的信息^2）。

　　外泌体是细胞外囊泡中直径较小(50~200nm)，从核内体的多胞体（MVB:multi-vesicular body）中释放而出。以前通常采用超速离心法或者密度梯度离心法来分离外泌体，但是采用这些方法很难完全去除外泌体中来自细胞本身的杂质。为了更进一步地研究外泌体，我们一直在寻找能分离出更高纯度外泌体的方法。作者利用和光纯药研发的新型外泌体提取试剂盒，尝试进行了外泌体的分离实验。该试剂盒中的试剂能够亲和外泌体表面的磷酯酰丝氨酸,从而实现外泌体的分离。用以前的超离心方法分离出的外泌体和使用本试剂盒分离出的外泌体在电子显微镜下观察图像如图1所示。使用超离心法提取的外泌体中混入了很多杂质，使用本试剂盒则成功分离出高纯度的外泌体。我们期待今后这种亲和提取方法能成为一种分离外泌体的标准方法。

图1.使用不同分离法时外泌体纯度的比较

◆外泌体和肿瘤的转移和恶化

　　自2007年发现外泌体中含有miRNA后^3），科学家开展了很多通过外泌体进行生物分子运输和其生物学意义的研究。特别是根据“肿瘤细胞会分泌更多的外泌体”、“外泌体中含有肿瘤特异性抗原，而外泌体能运输这些抗原”等的研究，外泌体作为一种新的诊断和治疗的靶标受到广泛的关注。为了显示肿瘤外泌体在微环境中的活动会促使肿瘤转移和恶化，本文将为大家介绍几个相关研究成果。

　　肿瘤在转移到其他组织时，需要在间质细胞间移动并到达血管中。科学家们发现，在这个过程中，外泌体通过纤维连接蛋白促进肿瘤细胞的运动性，再通过MT1-MMP蛋白酶促进细胞外基质的分解、血管新生及血管渗透性，来促进肿瘤转移^4-7）。此外，还发现了多数的肿瘤细胞对转移的组织具有指向性，而外泌体表面的整合素就是决定其指向性的因子。这些报道表明，αvβ5整合素决定了对肝脏、α6β4・α6β1整合素决定了对肺部的指向性^8）。这些报告是以外泌体为中心的肿瘤细胞-微环境之间复杂交流极其重要的报告。

　　在上述报导的基础上，以下是作者团队独自就EBV阳性淋巴瘤中外泌体作用进行研究的概述。

◆Epstein-Barr病毒（EBV）和恶性淋巴瘤

　　Epstein-Barr病毒（EBV）是从Burkitt淋巴瘤培养细胞中分离的最初的人体癌症病毒。CD21被认定为感染性受体，在试管中容易引起B细胞的转化。由此我们知道EBV编码的LMP（latent membrane protein）及 EBNA （EBV nuclear antigen）等9种基因控制了细胞内信号和转录因子的活性，导致了感染细胞的永生化和形态转化。

　　现在，世界上90%的人口都携带EBV，即处于潜伏感染状态，当由于各种各样的原因导致免疫力低下时，会引发B细胞性・T/NK细胞性淋巴瘤，极少数情况下还会引发鼻咽癌或胃癌等上皮细胞肿瘤。有报告显示在部分的B细胞性淋巴瘤里，用传统的方法进行治疗时，EBV呈阳性的病例比EBV呈阴性的病例治疗效果差，出现预后不良。人们强烈希望研发出针对EBV阳性淋巴瘤、替代现有治疗方法的特效新疗法。作者鉴于EBV阳性疾病治疗的现状，以EBV阳性淋巴瘤的发病及恶化的机制为核心进行了研究。

　　重要的一点是，EBV阳性淋巴瘤组织中浸润了很多免疫细胞，而肿瘤细胞依靠炎症微环境来生存。作者着眼于这点，对EBV阳性淋巴瘤外泌体对微环境的影响以及作为促进淋巴瘤恶化因子的EBV源miRNA活动情况进行了分析。

◆外泌体运送EBV来源的miRNA

　　EBV自身的染色体组上被称为BART（BamHI-A rightward transcripts）的领域里有编码miRNA簇。这个簇中编码了大约40种的miRNA，也有人称之为BART miRNA，本文统一称为EBV miRNA。现在，这些EBV miRNA在淋巴瘤发病和恶化中的作用还存在很大的争论。例如，有研究显示EBV miRNA抑制细胞凋亡有助于肿瘤生存，也有研究报道显示维持EBV的潜伏状态可以抑制肿瘤化^9）。

　　在此类研究中，Pegtel团队的研究发现，EBV阳性淋巴瘤细胞分泌出的外泌体中含有EBV miRNA^10）。这份报告表明了外泌体选择性进入人单核细胞来源的树突状细胞（MoDC），并运送EBV miRNA。从该结果可知，EBV阳性淋巴瘤中的外泌体对肿瘤组织中浸润的非肿瘤细胞的活性有一定影响，还能导致微环境的改变。

◆外泌体对淋巴瘤发病的影响

　　在Pegtel团队的研究的基础上，作者尝试进行同样的实验时，证实了淋巴瘤中的外泌体会选择性进入单核细胞/巨噬细胞。我们发现含有大量EBV miRNA的外泌体能促进巨噬细胞中TNFα和IL-10等基因的表达。这种基因的表达模式和在肿瘤微环境中浸润的TAM（Tumor-associated macrophage）非常相似，所以吸收含有EBV miRNA的外泌体的巨噬细胞可能在微环境的构成中发挥重要的功能。

　　接着，为了确认EBV阳性淋巴瘤中的外泌体能促进微环境构建，作者利用了EBV感染的小鼠模型。本来，EBV只会感染以人类为首的灵长类动物，但将人类脐带血中CD34阳性造血干细胞移植到免疫缺陷NOG小鼠上，如此可建立由EBV感染引发的淋巴瘤发病的小鼠模型。这个小鼠模型在被野生型EBV株（Akata）和EBV miRNA缺损株（B95-8）感染后，感染野生型株的小鼠预后较差，但感染miRNA缺损株的小鼠恢复情况良好。对此，作者尝试对感染miRNA缺损株的小鼠静脉注射含有miRNA的外泌体，发现小鼠竟然产生了淋巴瘤，而且肿瘤组织中浸润着大量的巨噬细胞。最后我们还发现，注入氯膦酸盐脂质体去除肿瘤中巨噬细胞的同时，肿瘤细胞也会减少。

　　上述结果表明，在EBV阳性淋巴瘤恶化的过程中，外泌体能利用巨噬细胞构建有利于肿瘤细胞的微环境。

◆结语

　　外泌体在刚被发现时，曾被认为是把多余的蛋白和核酸释放到细胞外的一种结构。但如今作为诊断和治疗以肿瘤为主的各种疾病的靶标而备受关注。本文着重介绍了肿瘤中外泌体的功能，并认为外泌体会参与到所有的生命现象中。虽然大多数的研究都已明确了外泌体的生物学意义，但其详细的功能还存在很多未知的部分。希望我们的研究能有助于今后对外泌体的研究。

【参考文献】

[1]　Quail, D. F. and Joyce, J. A. : Nat. Med ., 19 （11）, 1423（2013）.

[2]　Tkach, M. and Thery, C. : Cell , 164, 1226 （2016）.

[3]　Valadi, H. et al . : Nat. Cell Biol ., 9（6）, 654 （2007）.

[4]　Sung, B. H. et al . : Nat. Commun ., 6, 7164 （2015）.

[5]　Hoshino, D. et al . : Cell Rep ., 5, 1159（ 2013）.

[6]　Kosaka, N. et al . : J. Biol. Chem ., 285（ 23）, 17442（ 2010）.

[7]　Zhou, W. et al . : Cancer Cell , 25, 501（ 2014）.

[8]　Hoshino, A. et al . : Nature , 527, 329（ 2015）.

[9]　Ok, C. Y. et al . : Blood , 122（ 3）, 328（ 2013）.

[10] Pegtel, D. M. et al . : PNAS , 107（ 14）, 6328 （2010）.

Tim4蛋白亲和法分离高纯度外泌体的提取试剂盒！！

MagCapture^TM Exosome Isolation Kit PS

　　本试剂盒能从细胞培养上清及血清等样本中，通过亲和法轻松地分离出高纯度的外泌体。在外泌体膜囊表面的磷脂酰丝氨酸（PS）上使用结合了钙离子的Tim4蛋白，再通过螯合剂洗脱得到完整的外泌体。

◆特点

●　所有分离外泌体所需的试剂整合到一个试剂盒中，方便使用

●　能从培养上清、血清中分离出高纯度的外泌体

●　无需采用超速离心法，操作简单，能同时处理多个样本

●　能分离完整分外泌体，有助于开展下一步研究

●　回收效率高于超速离心法

●　还能用于提取微囊泡等细胞外囊泡

◆试剂盒组成

●　Streptavidin Magnetic Beads …………600μL×1

●　Biotin-labeled Exosome Capture ………100μL×1

●　Exosome Capture Immobilizing Buffer ..35mL×1

●　Exosome Binding Enhancer（ ×500） … 500μL×1

●　Washing Buffer ………………………… 75mL×2

●　Exosome Elution Buffer ……………………5mL×1

●　Reaction Tubes …………………………………22支

◆产品信息

◆相关商品

欲了解更多相关产品请点击文字：MagCapture™ 外泌体提取试剂盒

什么是外泌体

金泽大学医学系免疫学 教授

華山　力成

　　近年来，细胞外囊泡（EV）相关的研究正加速发展。2011年每年有约200篇相关论文发布，但2016年一年间有1000篇以上的相关论文发布，论文内容涉及各种生理功能和病理症状等方面。EV大致可分为核内体来源的外泌体和细胞质膜来源的微囊泡，但即便是用提取纯度最高的超速离心法也难以将二者完全分离，所以简单地将10,000×g离心后上清中的EV称为小EV（主要是外泌体）^1）。外泌体是由各种细胞分泌的小型膜囊泡（直径30~100nm），存在于大多数体液（如血液、尿液、髓液等）和细胞培养液中。外泌体是由脂质双层膜包被的膜囊泡，产生于称为多囊泡体的细胞外囊泡中，多囊泡体通过与细胞膜融合将外泌体释放到细胞外。外泌体含核内体来源的蛋白质（如ESCRTs）、细胞内运输相关蛋白（如RabGTPase等）及细胞膜来源蛋白（如CD63, CD81等）等各种内分泌细胞来源的蛋白和RNA，同时还含有分泌细胞膜来源和内体膜来源的脂质（如胆固醇和鞘磷脂等）^2）。多年来，外泌体被认为参与无用的细胞内含物质的释放。但是近年来，外泌体在活体内作为运载脂质、蛋白质、RNA等细胞间信息传递的新型媒介而倍受瞩目。随着其功能在生理及病理功能的阐明，外泌体在临床应用的相关研究中，特别是诊断治疗、生物标记的开发也迅速发展起来。

　　现在，外泌体研究几乎涉及所有的研究领域（免疫、神经系统、癌症、内分泌、循环系统等）。例如，免疫细胞来源的外泌体含有抗原肽/MHC复合体和可能控制着免疫细胞间抗原信息的交换、免疫细胞活化/非活化等各种免疫应答机制的各种抗原^3）。外泌体在神经系统中与神经回路的控制相关^4），同时各种神经退行性疾病的致病蛋白还可以通过外泌体释放到细胞外并传递到其他细胞，与病情发展密切相关^5）。 癌细胞释放的外泌体含有许多与血管新生和免疫逃逸相关的分子，构建适合癌细胞生长的微环境，促进癌细胞的发展^6）。另外，癌细胞来源的外泌体上粘着分子的表达形式决定着癌症向器官的转移途径^7）。最近，有报告指出脂肪细胞释放的外泌体对肝脏的遗传基因表达有控制作用^8）。许多病毒利用外泌体的产生路径感染细胞，受病毒感染的细菌和寄生虫通过外泌体控制其他受细胞感染的细菌、寄生虫的活动^9、10）。

　　上述这些功能几乎都是通过细胞分泌到外泌体中的分子引起的。其中已发现外泌体内含有分泌细胞来源mRNA和miRNA，外泌体与细胞间遗传基因表达信息的水平传播相关性倍受瞩目^11）。这些RNA被外泌体的脂质双层膜所保护，不会被核糖核酸酶所分解，可以在血液和体液中稳定存在。被靶细胞吞噬的外泌体通过与内体膜融合，将RNA释放到靶细胞的细胞质中。释放出来的mRNA翻译为蛋白质，但miRNA抑制目的基因的翻译，因此外泌体在靶细胞内控制基因的表达。外泌体的蛋白质有数万种，mRNA、miRNA的种类有数千种以上，它们的结构除了受细胞来源不同的影响，还受到细胞状态不同的影响。另外，外泌体中这些物质的结构与它们在分泌细胞内的结构不同，所以可能存在一种外泌体特异蛋白和mRNA/miRNA在外泌体内选择性积累的机制。这种特异性可将外泌体内的RNA作为生物标记，更进一步作为治疗开发方法的靶点。外泌体中的mRNA一旦被靶细胞吞噬，能够引起这个细胞内的功能性蛋白的表达，但外泌体中多数的miRNA是前体而非功能性miRNA，这些miRNA起着何种生理性意义，学者们正在研究。由于外泌体含有各种蛋白质、RNA和脂质，研究人员正将其进行细胞分类，建立数据库（ExoCarta）。此外，在世界各地分别进行着运用蛋白质组学、转录组学和系统生物学的大规模分析工作，而FunRich的EV plugin作为一种通用的分析手段已被公布出来。今后，在推进外泌体研究方面，各领域的研究人员信息共享至关重要。

◆运用外泌体进行治疗和诊断的功能开发

　　随着外泌体的功能逐渐被发现，近年来，应用这些功能的治疗法也在被开发出来。例如，血液中的成纤维细胞所释放的外泌体，可以促进角质形成细胞的移动和增殖以及血管新生来促进伤口愈合。有报导指出，外泌体内miRNA参与促进血管新生、抗炎症性和促进胶原蛋白沉淀等一系列过程^12）。从癌症患者树突状细胞释放的外泌体中，含有各种癌症细胞来源的蛋白质，可以强化杀伤性T细胞对癌症细胞的特异性反应。利用此功能的抗肿瘤免疫疗法，目前正处于初期临床研究阶段^13）。另外，科学家也尝试利用外泌体的抑制发病机制功能。例如，类风湿关节炎患者的滑膜成纤维细胞所释放的外泌体，高浓度集聚诱导细胞死亡的TNF-α，可使类风湿关节炎恶化^14）。通过上述介绍可以知道癌症细胞来源的外泌体含有与癌症进展相关的分子，神经细胞来源的外泌体含有与神经退行性疾病相关的分子，因此，通过抑制或去除这些外泌体，有希望抑制疾病发生。随着今后的研究发展，外泌体功能逐步清晰，并扩大临床应用，有望将外泌体应用在各种疾病治疗上。甚至可尝试利用外泌体将siRNA和抗癌药剂等运输到目标细胞中。各种细胞粘着分子在外泌体膜表面表达，由其决定外泌体被运输往哪一种细胞，期望开发利用该特征的新型DDS^15）。外泌体在体液中十分稳定，同时外囊泡所含的蛋白质和RNA被外泌体的脂质双层膜所包被也不会分解。另外在从体液中提取外泌体后，体液可长期稳定保存，因此外泌体有望成为临床检测的新型疾病生物标记。外泌体与各种疾病的相关性被检测出，特别是血液中释放的癌细胞来源的外泌体，其与正常细胞来源外泌体在结构分子上的差异倍受瞩目，并作为癌症早期诊断技术，应用于与癌症进展相关的研究^16）。甚至人们期望将尿液中的外泌体作为肾脏、前列腺疾病、膀胱疾病的新型诊断标记，髓液中的外泌体作为脑内肿瘤和神经退行性疾病的新型标记物。

◆外泌体研究的课题和展望

　　已经有许多关于外泌体作用的报导，根据这些现象实验中，从体液和培养上清中高纯度提取的高纯度外泌体，在活体内是否真的能发生作用尚未能确定。确认外泌体生理作用的唯一方法就是明确外泌体的释放机制，通过促进或抑制释放机制，分析会引起何种生理作用，这是进一步研究的发展方向。甚至活体内的外泌体动态（哪个外泌体迁移至何处）也会成为今后需要努力研究的重要课题。

　　目前，提取外泌体的方法主要有超速离心法、PEG沉淀法，但这些方法混有非常多的杂质，必须慎重分析得到的是否是外泌体。超速离心法存在操作繁杂、回收量不稳定，不能用于定量分析、必须使用昂贵的超速离心机、无法进行多样品分析等问题。因此外泌体研究相对困难，需要尽快开发操作简单、可提取高纯度外泌体的技术。因此，日本和光着眼于巨噬细胞的外泌体受体Tim4蛋白，制备Tim4细胞外域与磁珠结合的“Tim4磁珠”^17）。Tim4通过磷酯酰丝氨酸（PS）法特异性结合Tim4蛋白和磁珠，再经过含有EDTA的洗脱缓冲液进行分离，提取高纯度的完整外泌体。实际上，用PS亲和法提取的人白血病细胞释放的外泌体，其纯度与超离心法和PEG沉淀法提取外泌体做比较， PS亲和法提取的外泌体，其蛋白特异性检测可高出10~100倍以上，几乎没有混入外泌体以外的蛋白，回收量高，操作重复性好。结果表明，PS亲和法可以检测到许多目前为止都无法检测的外泌体蛋白质和RNA。应用Tim4的外泌体强结合能力，可用ELISA或FACS高灵敏度定性检测、定量分析外泌体。以前无法用超速离心法提取的微囊泡，也通过运用PS亲和法实现高纯度提取。本指导书中对该技术进行详细说明，这项技术的有用性今后将受到世界各方评价，有望在外泌体和微囊泡生理功能的分析研究上起重大贡献。

　　外泌体的检测和提取还遇到一个困难即：对各种外泌体的分类。研究人员尚未统一定义以何种方法提取的细胞外囊泡可以称之为外泌体，给实验数据的分析和重复性确认带来困难。近年，随着国际细胞外囊泡协会的成立、世界性研究者研讨会的举办，提案MISEV指南作为国际标准，计划或已经开始进行EV研究的科学家请务必阅读这些方针^18、19）。另外，建立记录各论文实验条件的数据库也可作为规避混乱的方法之一^20）。一方面，随着EV研究倍受世界瞩目，各国启动了大型研究项目。美国启动NIH战略性大型项目（Extracellular RNA Communication），国际权威性学会——Gordon和Keystone Symposia也从2016开始成立会议小组。受到欧洲药物研究开发公司“创新药物倡议组织（IMI）”的支持推进的CANCER-ID项目，也包含EV研究在内。2017年日本选定了EV研究为文部科学省研究开发战略的目标之一，期待会加速今后的研究发展。无论如何，今后EV研究的根本就是必须有强有力的研究方法和技术，而PS亲和法有望成为其中之一。

◆参考文献

PS亲和法外泌体提取试剂盒

　　MagCapture^™ Exosome Isolation Kit PS提取高纯度完整状态的外泌体。

　　外泌体是各种细胞外泌的直径在30-100nm之间的膜囊泡。因外泌体内含mRNA、microRNA等核酸和蛋白质对相邻细胞具有交换信息的功能。作为细胞间信号传导的通讯工具和作为癌等各种疾病的生物标记话题比较热门^1、2）。近些年关于外泌体研究很广泛，但是关于外泌体相关的实验技术，关于需要改进的课题存在很多。

　　例如，外泌体提纯方法中，超速离心法和聚合物沉淀法（市售试剂盒）混入多种杂质，给后续实验产生了许多障碍。抗体亲和法和密度梯度离心法，虽然可以提取到高纯度的外泌体，但不能提取完整外泌体，无法分析外泌体具有的生理功能，也是两种提取方法的问题所在。而免疫印迹法（WB）和Elisa检测法作为被广泛应用的外泌体检测的一般方法，又存在检测时需使用大量外泌体和难以检测到低表达水平的标记蛋白。

　　为了解决外泌体实验遇到的上述的各种问题, Wako 研发出MagCapture™外泌体提取试剂盒PS（MagCapture™  Exosome Isolation Kit PS）提取高纯度细胞外囊泡。

　　外泌体膜含有分泌细胞源的蛋白和脂质，众所周知磷脂酰丝氨酸（PS）在活细胞通过翻转酶作用导向细胞膜内侧，暴露在外泌体膜外侧^3）。另外，T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 4（Tim4 通过巨噬细胞进行细胞凋亡的吞噬受体）蛋白通过细胞外域IgV域与含有钙离子的PS结合^4）。

　　基于上述知识，我们利用Tim4固化磁珠，在钙离子存在下捕捉培养上清和血清等样品中的外泌体，再添加螯合剂洗脱外泌体，这种外泌体纯化方法是和金泽大学医学系免疫学华山教授共同开发，并取得了成功。^5）这是迄今为止取代黄金标准超速离心法的新型外泌体纯化方法。

◆参考文献

MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 PS

　　MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS采用磷脂酰丝氨酸（PS）亲和Tim4蛋白的PS亲和法，可方便获得高纯度的外泌体和其他来自细胞培养基和体液的EVs。提取的完整外泌体和其他EVs可用于不同实验：电镜分析，纳米粒子追踪分析，EVs的操作和分析等。

【特点】

●　可提取高纯度的完整外泌体

●　可从血清、血浆、尿液等样品中提取外泌体

●　重复性高，回收量稳定

●　操作简单，可处理多个样品（无需超速离心）

成功研发高纯度完整外泌体的提取新方法

—期待革新癌症等疾病的早期诊断及治疗效果的判断—

2016年9月23日

国立大学法人大阪大学

国立研究开发法人日本医疗研究开发机构

◆研究成果的要点

●　研发出提取高纯度完整细胞外囊泡和外泌体的新方法。

●　外泌体发挥作为癌细胞等患病细胞的生物标记物（注1）的作用，但用现有的提取法获得的外泌体

      纯度较低，作为生物标记物不可靠。

●　运用本研究成果提取高纯度外泌体的日本产试剂盒已在市面销售。

◆概要

　　大阪大学免疫学前沿研究中心的华山力成特聘教授（金泽大学医学系免疫学教授）、中井涉特任研究员以及和光纯药工业株式会社的研究团队，成功研发出简便且重复性高的外泌体高纯度提取法（图）。

　　用该方法提取的外泌体可用于确定此前外泌体上无法鉴定的蛋白或RNA，期待能够为以癌症为首的各种疾病的早期诊断及治疗效果的判断带来革新。

　　本研究成果在线刊登于英国的科学杂志《Scientific Reports》（日本时间9月23日18点）。

◆研究背景

　　外泌体是由各种细胞释放出的直径为30~100nm的细胞外囊泡。最近有报告显示，外泌体中含有的蛋白或RNA能发挥作为癌细胞等患病细胞生物标记物（注1）的作用，与疾病的早期诊断及治疗效果的判断关系密切。

　　但是，用现有的提取法获得的外泌体含有较多杂质，用作生物标记物的可信度较低。

图.使用Tim4磁珠的新型外泌体提取法

◆本研究的内容

　　华山特聘教授的研究团队在标靶细胞中发现了一种称为Tim4的膜蛋白的外泌体特异性受体。然后制作出可令Tim4的细胞外区域与磁珠结合的“Tim4磁珠”，建立并补充了细胞培养基及体液中外泌体的分离方法（图）。利用Tim4磁珠亲和法可捕获高纯度的人白血病细胞释放的外泌体，其回收纯度比以往的提取方法高10~100倍以上。

◆本研究成果对社会的影响（本研究成果的意义）

　　今后，利用本技术提取的外泌体除了用作癌症的生物标记物，还可用于免疫系统、循环器官系统、脑神经系统、内分泌系统等各种疾病的生物标记物的鉴定和分析。

　　此外，本技术无需使用超速离心机（注2）等昂贵设备，操作简便可在大部分临床检测现场使用。期待这项技术今后可应用在各种疾病的早期诊断、治疗效果的判断及预后预测中。

　　和光纯药工业株式会社根据该项技术开发生产的试剂盒MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS已在世界各地开始销售。

◆特别事项

　　本研究成果在线刊登于英国的科学杂志《Scientific Reports》（日本时间9月23日18点）。

作者：WataruNakai, Takeshi Yoshida, Diego Diez, Yuji Miyatake, Takahiro Nishibu, Naoko Imawaka, Ken Naruse, 

　　　YoshifusaSadamura and RikinariHanayama.

题目：A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles.

　　本研究包含在国立研究开发法人日本医疗研究开发机构（AMED）的“创新癌症医疗实用化研究业务”中，是研究开发课题“通过高纯度外泌体提取法鉴定新的肿瘤标记”（研究开发代表者：华山力成）的一部分研究成果。此外，大阪大学免疫学前沿研究中心（IFReC）是被日本文部科学省的“世界顶级研究基地计划（WPI）”选定的机构，是以用科学的力量引领世界为目标的研究中心。

◆研究内容的详细说明

研究背景

　　外泌体是各种细胞释放出的直径为30~100nm的细胞外囊泡，它作为一种在分泌细胞与标靶细胞间交换脂质、蛋白质、RNA等的新载体而备受瞩目。最近有报告发现，组成外泌体的分子（特别是蛋白质和RNA）能作为癌细胞等患病细胞的生物标记物（注1），而且与疾病的早期诊断、治疗效果的判断及预后预测关系密切。例如，恶性黑色素瘤细胞释放出的外泌体中含有高浓度的TYRP2、VLA-4、MET等蛋白，能用作预测肿瘤转移可能性或发展情况的标记物（Nat Med.18:881-891(2012)）。另外，外泌体中含有大量来源于分泌细胞的mRNA或non-coding RNA，只需微量的样本就能用PCR法进行扩增，作为划时代的生物标记物可广泛用于和疾病相关性及特异性的研究中（BiochimBiophys Acta.1806(2):200-207(2010)）。

　　现时主要使用超速离心法（注2）或PEG沉淀法（注3）提取外泌体，但此类方法提取出的外泌体含有较多杂质，用作生物标记物不可靠。超速离心法存在很多弊端，不仅操作复杂回收量不稳定，无法进行定量分析，还需要购买昂贵的超速离心机，无法同时进行多个测量样本的分析。以上情况限制了外泌体作为生物标记物的使用，所以人们希望研发出一种能简便提取高纯度外泌体的技术。

◆本研究成果的内容

　　我们在标靶细胞中发现了一种叫Tim4的膜蛋白的外泌体特异性受体。发现Tim4的细胞是通过Tim4的细胞外区域的IgV结构域，在钙离子存在的情况下强力结合外泌体膜表面的磷酯酰丝氨酸（PS），然后将外泌体吸收到细胞中。因此，我们制作出可令Tim4细胞外区域和磁珠结合的“Tim4磁珠”。Tim4依赖钙离子结合外泌体表面的PS，所以能用含有螯合剂（注4）EDTA的洗脱缓冲液（注5）高效地洗脱并提取出高纯度的外泌体（图1）。

　　实际上，比较用Tim4磁珠法提取人白血病细胞释放出的外泌体和用超速离心法或PEG沉淀法提取的外泌体的纯度时，Tim4磁珠法能以良好的重复性回收高纯度的外泌体，比其他方法提取的外泌体纯度高10~100倍以上（图2）。这样，就能确定大多数之前无法鉴定的外泌体上的蛋白质和RNA。从上述的结果可知Tim4磁珠法是有效的，并成功地研发出了简便且能提取高纯度外泌体的方法。

图1.使用Tim4磁珠的外泌体提取法

　　Tim4磁珠依赖钙离子与外泌体膜表面的磷酯酰丝氨酸结合。通过使用EDTA螯合钙离子，能解离亲和了Tim4磁珠的外泌体。

图2.各种外泌体提取法的纯度比较

　　Tim4磁珠法与超速离心法及PEG沉淀法相比，不仅能强力检测出外泌体特异性蛋白（左），而且几乎不会混入外泌体以外的杂质（右）。

◆本研究成果对社会的影响（本研究成果的意义）

　　近年，有关外泌体的研究进展迅速，但事实上我们并不知道，在研究中使用超速离心法或PEG沉淀法提取的低纯度外泌体是否能发挥其原有的作用。期待这次我们研发的外泌体高纯度提取技术能够成为改变外泌体研究方法的革新分析技术。今后，利用本技术提取出的外泌体不仅用作癌症的生物标记物，还能用作鉴定和分析免疫系统、循环器官系统、脑神经系统、内分泌系统等各种疾病的生物标记物。此外，本技术无需使用超速离心机等昂贵设备，简便的操作可在大部分临床检查现场使用。期待今后这项技术可应用在各种疾病的早期诊断、治疗效果的判断及预后预测中。和光纯药工业株式会社根据该项技术开发生产的试剂盒MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS已在世界各地开始进行销售。

◆术语说明

（注1）：生物标记物

　　血液或尿液、脊髓液等体液中含有的蛋白质或RNA等物质，其浓度可作为特定的疾病存在或进展情况的相关指标。

（注2）：超速离心法

　　使用超速离心机对样本施加强大的离心力从而分离样本成分的方法。

（注3）：PEG沉淀法

　　使用聚乙二醇（PEG）从试剂中沉淀出高分子的方法。

（注4）：螯合剂

　　结合金属离子，阻止金属离子作用的物质。

（注5）：洗脱缓冲液

　　解离特定的物质之间结合的溶液。

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外泌体和生命现象——第二回 外泌体蛋白质组解析

公益基金会癌症研究小组 植田 幸嗣

　　外泌体是一种微分泌囊泡。它是细胞内囊泡转运的产物之一，具有将不需要的分子释放出细胞外、并将内含分子运输和传递到远端细胞的功能。通常，外泌体具有直径为几十至一百纳米的脂质双分子层结构，与细胞结构成分相比，特定蛋白质组（四次跨膜蛋白超家族，Rab家族，Tsg101，Alix等）和miRNA的含量特别多。然而，有研究结果指出，通过细分粒径进行组学分析时，发现特定粒径的分子结构明显不同^1），所以如今外泌体的分子生物学定义仍未明确。事实上，有不少报道认为通过使用各种不同的外泌体提取方法（使用提取纯度不同的外泌体样本）进行的功能分析实验发现，外泌体参与癌症转移、肿瘤浸润、血管新生、免疫细胞调节等现象。

　　另一方面， "从释放到外周血等体液中的、来自致病细胞的外泌体中，可以读取致病细胞的分子谱"这一点已被证实了。以诊断为目的外泌体应用已经商业化。例如，在CLIA（Clinical Laboratory Improvement Amendments）认证的实验室开发的，通过尿液中的外泌体同时检测前列腺癌特异性PCA3非编码RNA，ERG mRNA，SPDEF mRNA的测试（ExoDx^® Prostate IntelliScore），并且可以作为LDT（Laboratory Developed Tests：实验室内部研发、验证、使用的体外诊断测试）进行国际委托技术服务^2）。此外，Wako还建立了一项从血浆中一步分离外泌体DNA/RNA及cfDNA（circulating free DNA）的技术，并发表了一项从血液样本中检测非小细胞肺癌EGFR-T790M突变的检测方法（ExoDx^® EGFRT 790 M）。该突变导致60％接受EGFR抑制剂治疗的肺癌患者产生耐药性。有这种EGFR突变，就应及时替换Osimertinib等有效药物进行治疗，故快速的耐药诊断非常重要。通过对210例EGFR突变肺癌患者的对比试验，目前认可的cfDNA诊断法（cobas^® EGFR Mutation Test v2）检测T790M的灵敏度是58%，特异性是80%；而ExoDx^® EGFR T790M 检测的灵敏度是92%，特异性是89%。相比之下，ExoDx^® EGFR T790M 检测可获得更好的诊断结

果^3）。

　　在此背景下，无论是基础生物学研究还是临床应用，都需要实验室之间能够零差异再现的高纯度外泌体，一种任何人能轻松分离和纯化外泌体的工具是不可或缺的。特别是，如果研究对象是从血清和血浆样本中提取纯化的外泌体蛋白，则需要非常高的纯化水平。血清·血浆的蛋白浓度超过60mg/mL，还存在许多高分子量复合物如脂蛋白，即使是外泌体提取常用的超速离心沉淀法，仍然会存在大量血清游离蛋白（IgM，α2 -巨球蛋白，补体成分等）和脂蛋白。因此，通过LC/MS对超速离心法提取的血清蛋白进行全面定量蛋白质组分析时，几乎所有含量都是血清游离蛋白，只检测出了微量的外泌体蛋白。^4）

　　除超速离心法外，外泌体的提取方法还有抗体亲和法、聚合物沉淀法、凝胶过滤法以及从切除的组织浸液中直接回收的方法^5） 等。MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS（下文称为MagCapture试剂盒）的原理是亲和纯化磷酯酰丝氨酸PS （磷酯酰丝氨酸是构成外泌体膜的脂质之一）。与其它方法相比具有各种各样的优点。固定在磁珠上的Tim-4蛋白与PS在钙离子存在的条件下结合，通过螯合剂洗脱，可以不洗脱非特异性磁珠结合蛋白而特异性洗脱外泌体，因此提取的纯度很高。另外，只要磁珠纯化操作可以顺利进行，就不受样本容量的限制，即使是用稀释的样本也同样有效。此外，由于在没有变性溶解的情况下进行洗脱，后续的粒子计数检测、显微镜检查和细胞给药实验等应用均可放心使用。

　　根据图1A的方法，从相同血清中提取外泌体，并通过Orbitrap Fusion Lumos质谱仪进行综合蛋白质组分析。结果显示，超速离心提取外泌体的总蛋白质鉴定数为612种，MagCapture试剂盒提取外泌体的总蛋白质鉴定数为1,103种，后者是前者的约1.8倍（图1B）。这是因为超速离心法的血清中残留大量的游离蛋白质，掩盖了微量外泌体来源的信号。此外，比较鉴定的蛋白质以及相对定量值，可以看出，MagCapture试剂盒提取的外泌体中，被认为是外泌体标记蛋白的恒定分子组合以及相对含量都要更多（图2）。由此可见，通过试剂盒提取的外泌体纯度远高于现有的超速离心沉淀法。

　　使用高纯度的外泌体，有利于阐明外泌体的功能以及探索诊断和治疗药物，使研究结果更具可信度。从外泌体提取的纯度、灵活性、可重复性等方面来看，MagCapture试剂盒适合作为所有外泌体研究的起点。但是，通过该试剂盒回收的产物也是一组含有大量PS膜组分的无限定尺寸的集合，是否等同于其他现有研究指出的外泌体，还需要后期的组学分析来进行仔细评估和定义。随着包括MagCapture试剂盒在内的提取纯化技术以及检测技术的发展，我们期待对外泌体的本质阐明和临床应用的进一步发展。

图1. 提取纯度对外泌体蛋白质组分析的影响

A）通过超速离心沉淀法和MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS提取血清中的外泌体并进行质谱分析

B）鉴定出的蛋白数量和重叠部分

图2. 鉴定外泌体蛋白质的定量顶视图

A)   MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS及B)超速离心沉淀法提取血清中外泌体的蛋白质组定量分析结果

B）收集并记录了有报道作为外泌体标记物的蛋白。

◆参考文献

◆产品列表

MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS

外泌体和生命现象——第四回 外泌体糖链分析建议

庆应义塾大学 医学部医化学 松田 厚志

细胞分泌的细胞外囊泡中，粒径为100 nm左右的囊泡称为外泌体，外泌体内含有固有的蛋白以及microRNA等。另外，由于表面存在脂质和糖蛋白，外泌体成为继血液循环肿瘤细胞和血液循环DNA后的第三个被关注的液体活检标记物，并且现在世界各国也竞相开展以microRNA、蛋白组学分析为中心的研究。外泌体的最外层与细胞一样被糖链覆盖，在外泌体标记开发中糖链可作为合适的标靶。用于临床上的肿瘤标记物识别多种不同糖链结构，如果可以捕捉到疾病特异性外泌体上糖链的变化 ，则可以期待将外泌体应用于生物标记的开发。

大部分蛋白在经过糖基化等翻译修饰后都可作为功能蛋白发挥作用。糖链被称为继基因、蛋白质之后的第三生命链，并与细胞增殖、分化、细胞应答等多种生命现象相关。另外，癌症、免疫疾病、感染病、阿尔茨海默症等大多是与糖链相关的疾病，尤其是癌症，癌症的转移、侵袭、增殖等已阐明了糖链的重要性。在癌症的诊断、治疗法的开发中，对于糖链研究的期待值很高，阐明糖链的分子生物学意义已成为重要的课题之一。

与链状的核酸和氨基酸序列相比，糖链存在多样性的分支和不同的结合形式（α，β- 结合），糖链不能像核酸那样扩增，并且只限使用蛋白质样探针（抗体）进行解析，这使得糖链的分析更为困难。然而，最近以质谱，微阵列技术为中心的糖链分析技术发生了惊人的革新，迄今为止已经报道了许多新的糖链肿瘤标记以及开发方法的案例。糖链这种高门槛的研究，随着这些技术的革新，现在使得每个人都可以轻松地进行分析研究。至今为止，研究人员利用结构特异性识别糖链的结合蛋白，并固定了几十种凝集素的凝集素微阵列系统^1），进而促进了各类糖链生物标记物的开发^2,3）。本方法的优点是与质谱分析相比，其灵敏度与通量方面更为优越（图1）。作为本系统应用的一环，能够实施对多种生物样本进行解析的实验方案，现在，凝集素阵列（Lectin‐Array）分析的对象涉及多方面，如体液、组织、细胞等等。粒子状的外泌体与细胞相比粒径虽然很小，但其表面却存在无数的糖蛋白、糖脂糖链。因此，可以成为很好的凝集素阵列分析对象。凝集素阵列（Lectin‐Array）分析是通过几十种的凝集素结合方式来推断糖链结构，进而发现与比较对象有差异的糖链（凝集素）模式，这被称为糖链分析。我们采用的外泌体分析实验是将提纯的外泌体粒子上的蛋白标记荧光。因此，外泌体的回收及其颗粒形态的保持是十分重要的。另外，因为凝集素微阵列具有高灵敏度，即使回收量低也可以进行分析，但是如果混入其他糖蛋白的话就会造成干扰，无法进行正确的糖链分析。因此，对提取的外泌体的纯度是有要求的。为了能够得到高纯度并保持完整颗粒状态的外泌体，使用MagCapture^TM Exosome Isolation Kit PS （下文简称为MagCapture）进行了外泌体提取实验。该试剂盒在后述的血液中外泌体糖链分析时发挥了出色的作用。

图1. 凝集素微阵列系统和外泌体糖链分析的流程

首先，我们以培养细胞作为模型，从培养上清中分离、提取外泌体，接着尝试通过凝集素微阵列进行糖链分析比较。作为比较对象，从相同细胞株的沉淀中提取细胞膜蛋白，并对蛋白上的糖链进行分析比较（图2）。从3种类型的胰腺癌细胞株（Capan-1,-2, HPAF-II）中获得的凝集素阵列数据进行层次聚类分析后发现，这些数据不是反映细胞株之间的差别，而是出色地反映出了膜蛋白和外泌体之间凝集素的差异（图2A）。说明了即使是相同的细胞株，其细胞膜糖蛋白上糖链和分泌的外泌体上糖链的结构也是不同的。另外，即使都是外泌体，它详细的糖链图谱结果也是不同的（图2B），由此可以看出，将外泌体用作糖蛋白分析比较的标记是可行的。

图2. 胰腺癌细胞来源外泌体和细胞膜糖蛋白的糖链比较图

（A）通过层次聚类分析进行clustering

（B）各细胞株来源细胞膜蛋白，外泌体表层糖链的凝集素阵列结合形式

以培养上清液作为模型的外泌体分析已取得了一定程度的进展。进行血清来源外泌体的比较分析时，由于含有混杂的糖蛋白，因此要极为小心。换言之，在进行血液中外泌体糖链分析时，提取高纯度的外泌体是十分重要的。比较了超离法、聚合物沉淀法和MagCapture三种外泌体提取方法并进行糖链的分析。使用超离法和聚合物沉淀法时，健康者和癌症患者的糖链分析结果的差异不是很大。原因是用该类方法提取的外泌体组分用电泳分析后，可以看到过量的以球蛋白为首的血清糖蛋白的条带，这会干扰糖链的分析比较，而血清外泌体糖链分析中，使用可以提取高纯度外泌体的MagCapture可能是较为合适的试剂盒。最后根据MagCapture试剂盒提取外泌体的实验流程，作为凝集素阵列分析中必要使用的外泌体量，在换算后仅相当于数微升的血清样品量，因此，确认该方法可以用于血液中高灵敏度的外泌体糖链分析比较实验。并且本试剂盒提取的外泌体可以很好的保持完整颗粒状态。根据该实验流程，实际上可以在健康者和疾患群（A、B、C）混合血清中进行外泌体的比较糖链分析。分析主要成分的结果中显示，各患者血清外泌体表层的糖链分析结果都有所不同（图3），建议将外泌体糖链作为新的外泌体诊断指标。

图3. 血清外泌体的比较糖链分析图

（A）各混合血清中提取外泌体的银染和抗CD63抗体蛋白印迹

（B）使用了凝集素阵列分析数据的主要成分分析

现在正在尝试开发临床应用的糖链外泌体标记物。以基因组和蛋白组学分析为中心的外泌体的本质正逐渐被阐明。近年，随着不断创新的血液中外泌体检测方法的开发，对外泌体进行定量检测成为了可能，使其临床应用也更进了一步。如果可以发现疾病特异性外泌体糖链，就可以期待应用这样创新的外泌体定量系统，开发出实用的标记物。通过与其他组学分析的结合，发现特异性糖链的验证方法等还有很大的改良空间，但是我们已经迈出了外泌体糖链标记物开发的第一步。

◆参考文献

1）Kuno, A. et al. : Nat. Methods, 2, 851 （2005）.               

2）Matsuda, A. et al. : Hepatology, 52, 174 （2010）.

3）Matsuda, A. et al. : Anal. Chem., 87, 7274 （2015）.          

4）Yoshioka, Y. et al. : Nat. Commun., 5, 3591 （2014）.

5）Kabe, Y. et al. : Clin. Chem., 64, 1463 （2018）.

◆MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS

外泌体和生命现象——第三回 细胞老化和外泌体

公益财团法人癌研究会 爱研究所 细胞老化项目 冈田 辽

国立研究开发发热科学技术振兴机构 高桥 晓子

◆前言

日本人的平均寿命每年都在持续延长，世人皆知如今日本已成为屈指可数的长寿国。然而，像癌症、动脉硬化、阿尔茨海默病、肺纤维化、骨质疏松等随之而来的老年病的增加，已成为深刻的社会问题。老年病的发病原因各有不同，最近有报道称引发老年病的诱因之一，可能是随年龄增长储存在体内的老化细胞。老化细胞是指在生物体内发生了“细胞老化”、且细胞发生了不可逆停止增殖的细胞。众所周知，老化细胞会分泌出各种炎症蛋白；但我们研究发现老化细胞不仅分泌炎症蛋白，还促进外泌体的分泌，因此老年病与外泌体的研究分析还在持续进行。本文主要就老化细胞分泌外泌体为中心的研究发展进行了概述。

◆细胞老化是什么

除去部分的组织干细胞，构成我们身体的大部分细胞的分裂次数是有限的，正常的体细胞达到细胞寿命并不可逆地停止增殖的状态称为细胞老化^1）。另外，就算添加活性正常的细胞至有致癌危险的应激反应（染色体缩短、癌基因的活化、氧化应激等）中，还是会被细胞老化诱导而不可逆地停止增殖。因此，我们认为细胞老化与细胞凋亡相同，有防止异常细胞增殖、抑制癌症的作用^2）。然而，细胞老化不同于细胞死亡，老化细胞会在生物体内长期生存，因此随着年龄的增长，体内的老化细胞会越来越多^3）。另一方面，老化细胞中的染色质结构会根据持续的DNA损伤应答而改变，如炎症性细胞因子、趋化因子、基质分解酶和增殖因子等各种炎症蛋白基因活化表达^4）。已知老化细胞会分泌炎症蛋白到细胞外，这样的细胞老化的表现型被称为SASP（Senescence-associated secretory phenotype）。从老化细胞中分泌出来的SASP因子会引发周围组织的慢性炎症，可以看出这很可能是形成老年病的原因^5）。我们在分析老化细胞分泌的SASP因子的过程中发现，SASP因此还能促进老化细胞外泌体的分泌⁶⁾。

◆外泌体是什么

外泌体是直径约为50~150 nm的细胞外囊泡，是细胞膜内吞成为内体，再成为多泡体而形成的。外泌体含有蛋白质、脂质、核酸等细胞内组成分子，并具有将其转运到其它细胞的功能，因此近年来有报道称外泌体具有细胞间信息传递的作用，引起了广泛地关注^7）。

◆细胞老化和外泌体

使用人正常纤维细胞诱导的具有分裂寿命的细胞老化（eplicative senescence）和癌基因RasV12活化的细胞老化（Oncogene-induced senescence），用NTA（Nanoparticle Tracking Analysis）检测外泌体的分泌量后，老化细胞的分泌量比年轻细胞高约30倍^6）。因此，我们针对老化细胞中促进外泌体分泌的生物学机能进行了分析。分别敲除老化细胞中参与外泌体生物合成和分泌的Alix 和 Rab27a两个基因，切断外泌体的通道后诱导细胞凋亡状的细胞死亡。令人惊讶地是，即使是年轻增殖中的正常细胞，切断外泌体的路径也会激活DNA损伤应答和诱导细胞死亡，所以正常的细胞有可能会通过外泌体通道将有些有害物质分泌到细胞外。因此，我们在探索分泌外泌体的正常细胞中引发DNA损伤的诱导分子过程中，发现了其细胞质中的基因组DNA片段。细胞质中存在的DNA片段通过细胞质DNA传感（cGAS-STING 通道）被感知，从而引起自然免疫应答。总之，正常的细胞通过外泌体将有害的基因组DNA片段分泌到细胞外，防止对自身DNA的自然免疫应答。外泌体还作为如腺病毒等的外来性DNA病毒感染的屏障，表明外泌体通道是维持细胞稳定性的重要的生物体防御机制之一^6）。

在正常的细胞中，细胞质中的DNA片段可通过DNase2a 和 TREX1等DNA分解酶快速清除，但是我们发现老化细胞中DNA分解酶的表达水平下降^8）。为此，我们报道了在老化细胞中，储存在细胞质中的基因DNA片段通过激活DNA感应通道引起自然免疫应答，诱导SASP，参与肥胖引起的肝癌的病发（图1）。

图1. 老化细胞和外泌体

◆作为SASP的外泌体

众所周知，癌微环境中的老化细胞作为CAFs（Cancer-associated f ibroblasts）通过SASP因子促进癌细胞的增殖和转移和浸润。我们为了调查老化细胞分泌的外泌体的机能，分别向从年轻细胞和老化细胞中回收外泌体片段，分别向其中添加乳癌细胞株（MCF-7），观察到只有老化细胞分泌的外泌体片段对癌细胞的增殖有促进作用。接着，从各个细胞中回收的外泌体片段进行蛋白质组分析，结果显示，在老化细胞分泌的外泌体中， Ephlin-A2（EphA2）（酪氨酸激酶型受体之一的癌转移促进因子）的含量显著增加。并且，由于调节EphA2去磷酸化的PTP1B失活，外泌体会选择性地摄取被磷酸化的EphA2，我们发现在老化细胞中，外泌体有存在决定装载何种物质的机制。因此，指出老化细胞分泌的外泌体膜上的EphA2与癌细胞中高表达的受体（Ephlin-A1）相结合，通过激活下游的Erk信号来促进癌细胞的增殖。在该研究中我们明确发现了老化细胞来源的细胞外分泌膜囊泡作为促进癌细胞增殖的SASP因子起作用^9）。

◆结语

外泌体迄今为止作为细胞间信息传递工具的功能和诊断工具的实用性被关注并研究，但是细胞为何会分泌外泌体，其在生物学的意义上还有许多的未解之谜。最近，有报道称通过去除下丘脑干细胞和祖细胞的早衰症模型小鼠实验，调节下丘脑干细胞来源的外泌体中miRNA量改变了老年病的发病速度和个体寿命^10）。而且由于将有治疗效果的特定的siRNA和mRNA加载到外泌体并送入靶细胞的技术不断被开发^11,12），所以期待今后外泌体可以不仅作为疾患的生物标记，还能作为 DDS（Drug delivery system）被有效运用。

◆参考文献

１） Hayflick, L. : Exp. Cell Res., 37, 614 （1965）.

２） Takahashi, A. et al. : Nat. Cell Biol., 8, 1291 （2006）.

３） Yamakoshi, K. et al. : J. Cell Biol., 186, 393 （2009）.

４） Takahashi, A. et al. : Mol. Cell, 45, 123 （2012）.

５） He, S. et al. : Cell, 169, 1000 （2017）.

６） Takahashi, A. et al. : Nat. Commun., 8, 15287 （2017）.

７） Tkach, M. and Théry, C. : Cell, 164, 1226 （2016）.

８） Takahashi, A. et al. : Nat. Commun., 9, 1249 （2018）.

９） Takasugi, M. et al. : Nat. Commun., 8, 15729 （2017）.

10） Zhang, Y. et al. : Nature, 548, 52 （2017）.

11） Kamerkar, S. et al. : Nature, 546, 498 （2017）.

12） Kojima, R. et al. : Nat. Commun., 9, 1305 （2018）

【综述】外泌体在免疫系统中的作用

本文由金泽大学医学系免疫学华山力成教授执笔，收录于和光纯药时报Vol.84 No.1（2016年1月号）

◆前言

图1.　外泌体在免疫系统中的作用

在我们的身体中，大约有60万亿个细胞通过互相交流和交换信息来维持我们的生命活动。其中，各种细胞通过释放出一种被称为外泌体、直径为30~100 nm的小型膜囊泡来传递信息，近年来引起了广泛的关注。

外泌体是被脂质双分子层膜包围的膜囊泡，在被称为多囊泡胞内体的细胞内囊泡中产生，多囊泡胞内体与细胞膜的融合后被释放到细胞外（图1）。

外泌体中除了含有核内体来源蛋白（ESCRTs、TSG101等）、细胞内运输相关蛋白（Rab GTPase等）或细胞膜来源蛋白（CD63、CD81等）等分泌细胞来源蛋白外，还包含了分泌细胞的细胞膜和核内体膜来源的脂质（胆固醇、鞘磷脂等）^1）。

多年来，外泌体一直被认为是将这些细胞内组分作为废物排出的一种机制，但近年的研究发现，外泌体是分泌细胞与靶细胞之间交换蛋白和脂质的重要媒介。免疫细胞来源的外泌体中含有抗原肽-MHC复合物和各种抗原，能够控制免疫细胞之间抗原信息的交换、免疫细胞的活化和抑制等多种免疫应答现象（图1）。

研究还发现，外泌体内存在分泌细胞来源的mRNA和miRNA，能够参与细胞间遗传信息的传递与控制。在本文中，我们主要阐述外泌体在免疫系统中的作用，以及至今的研究发现和未来的研究前景。

◆抗原提呈中外泌体的作用

图2.　免疫系统中外泌体的组成分子

树突状细胞是免疫系统中分泌外泌体最活跃的细胞。树突状细胞是抗原提呈细胞的一种，能通过吞噬入侵体内的细菌等异物，在切断抗原肽后，与 MHCⅡ类分子结合并提呈在细胞表面来激活T细胞。

此外，细胞内的抗原肽利用MHCⅠ类分子提呈，树突状细胞分泌的外泌体携带MHCⅠ类和Ⅱ类分子（图2），它们分别与抗原特异性CD8⁺ 细胞杀伤性T细胞、CD4⁺ 辅助T细胞的T细胞受体结合，在远离树突状细胞处也可以激活T细胞。

然而，由于激活T细胞的重要共刺激分子在外泌体表面的表达量比在树突状细胞表面的表达量低，因此，与树突状细胞直接激活T细胞的情况相比，外泌体的激活能力要低5~10%。外泌体不仅能通过运输抗原肽-MHC复合物来实现直接的抗原提呈作用，还可通过渗入其他抗原提呈细胞，将抗原传递给细胞内的MHC分子，间接促进抗原提呈作用^2）。

外泌体除了含有抗原肽-MHC复合物外，还含有各种分泌细胞来源的抗原，可运输至抗原提呈细胞（图2）。

例如，在癌细胞来源的外泌体中含有癌细胞来源的各种蛋白质，它们被树突状细胞摄入后，通过抗原蛋白的分解和MHCⅠ类分子的交叉呈递，激活具有癌细胞特异性的细胞杀伤性T细胞^3）。

通过利用这个机制，可以开发癌细胞来源的外泌体抗肿瘤免疫疗法。巨噬细胞等吞噬细胞来源的外泌体中含有吞噬的细菌来源的抗原，通过外泌体将这些抗原转移到抗原提呈能力更强的树突状细胞中，可促进T细胞的有效激活^4）。有望利用这个机制，开发有效的疫苗。

◆通过外泌体传递RNA

外泌体不仅含有蛋白质抗原，还含有分泌细胞来源的mRNA或non-coding RNA（特别是miRNA），其功能引起广泛关注^5）。外泌体的脂质双分子层膜可保护这些RNA，不被RNase分解，在血液、体液中稳定存在。在外泌体及其分泌细胞中均可检测出RNA，也存在仅能在其中之一检测出RNA的情况，因此我们设想存在一种可以选择性将特定的RNA吸收至外泌体的机制。

进入靶细胞的外泌体与核内体膜融合，将其运载的RNA释放至靶细胞的细胞质中。释放出来的mRNA被翻译成蛋白质，而miRNA却抑制靶基因的翻译，因此表明外泌体可以调节靶细胞内的基因表达。

在免疫系统中，设想这个机制是遭遇外敌入侵的免疫细胞通过RNA向未遭遇入侵的细胞水平传递自身的活性状态，二者可以共同作为抵御外敌入侵的一种手段。

◆外泌体的免疫应答调节

外泌体装载着各种免疫相关分子，通过这些分子来调节免疫应答。例如，在细胞杀伤性T细胞或者自然杀伤性细胞来源的外泌体上，携带Fas配体、TRAIL、CD40配体等TNF家族蛋白，可诱导靶细胞凋亡^6）（图2）。

有报道称，癌细胞中也可以释放装载着Fas配体或TRAIL等的外泌体，诱导免疫细胞凋亡，使癌细胞免受免疫细胞的攻击^7）。一般情况下，TNF家族蛋白以膜结合形式产生，被膜型金属蛋白酶切割后转变为可溶性蛋白。膜结合蛋白主要担负诱导细胞凋亡的功能，但可溶性蛋白的活性较弱^8）。

外泌体上的TNF家族蛋白不能被膜型金属蛋白酶切割，故较为稳定，同时借助膜形成三聚体，具有很强的诱导细胞凋亡的活性。而且，人们认为外泌体的转运TNF家族蛋白，与各种炎症疾病和自身免疫疾病的产生相关。

例如，从类风湿关节炎患者的滑膜成纤维细胞中释放出来的外泌体上，聚集高浓度的膜结合型TNF-α，会加重类风湿关节炎病情^9）。

也有报告指出，癌细胞来源的外泌体，除了能诱导免疫细胞凋亡外，还具有各种免疫抑制效果。例如，当外泌体作用在自然杀伤细胞时，可抑制癌细胞识别机制中的NKG2D受体的表达，从而降低癌细胞的杀伤性^10）。

另外，如果癌细胞来源的外泌体进入单核细胞，通过外泌体内所含的TGF-β或前列腺素E2等的作用，单核细胞会被诱导分化为髓源性免疫抑制细胞^11）。髓源性免疫抑制细胞释放出IL-10等各种免疫抑制分子，抑制免疫细胞活化或抑制T细胞的诱导，从而抑制抗肿瘤免疫。癌细胞通过利用抑制免疫细胞攻击自身这一机制，进而促进癌症的发展。

◆结语

本文聚焦外泌体在免疫系统中的作用，阐明外泌体由神经系统、内分泌系统等各种类型的细胞释放出来，通过运输蛋白质、脂质、mRNA和miRNA等物质，参与各种生理现象和疾病发展。

已知外泌体会随着年龄的增加显著增多，因此也有人认为，外泌体也与增龄带来的组织萎缩相关。本文中记载了到目前为止关于外泌体在免疫系统中的作用，如在抗原提呈、炎症疾病/自身免疫疾病、癌症的进展等方面的作用，但这些现象的验证实验，是通过从培养细胞上清中提纯浓缩外泌体实现的，但还不能确定在生物体内也存在这些作用。

揭示外泌体生理作用的唯一方法就是明确外泌体的释放机制，通过刺激或抑制这些机制，阐明其引起的生理现象，并期待更进一步的研究。

截至目前，提取外泌体的方法主要是PEG沉淀试剂盒法和超速离心法，但这两种方法所提取的外泌体中所含杂质非常多，根本无法确定实验结果是否与外泌体的组成分子有关。

和光纯药成功开发出了新型提取试剂盒（产品编号：293-77601），通过利用与传统产品截然不同的提取机制，可提取到纯度极高的完整外泌体，对了解外泌体本身的生理现象具有极大帮助。

通过了解外泌体在免疫系统中的作用，还可利用外泌体开发新型的治疗方法。如本文所述，通过抑制癌细胞来源的外泌体的功能，可提高抗肿瘤免疫的效果。另外，通过移除癌症患者血液中癌细胞来源的外泌体，也可能成为一种有效的治疗方法。

反之，通过控制树突状细胞等的功能，促进免疫抑制性外泌体的产生，也可以应用于炎症患者或自身免疫疾病患者的治疗上。期望经过今后的研究发展，可以增加对外泌体功能的认知及扩大其在临床研究上的应用，并将外泌体应用于各种疾病治疗中。

◆参考文献

  1.　Colombo, M. et al. : Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 30, 255 (2014).

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  3.　Wolfers, J. et al. : Nat. Med., 7, 297 (2001).

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  5.　Valadi, H. et al. : Nat. Cell Biol., 9, 654 (2007).

  6.　Monleon, I. et al. : J. Immunol., 167, 6736 (2001).

  7.　Andreola, G. et al. : J. Exp. Med., 195, 1303 (2002).

  8.　Tanaka, M. et al. : Nat. Med., 4, 31 (1998).

  9.　Zhang, H. G. et al. : J. Immunol., 176, 7385 (2006).

10.　Taylor, D. D. et al. : Clin. Cancer Res., 9, 5113 (2003).

11.　Valenti, R. et al. : Cancer Res., 66, 9290 (2006).

外泌体的冻存

近来关于细胞外RNA（exRNA）和细胞外囊泡（EV）报道的涌现，凸显了外泌体及其内含物作为疾病和治疗靶标的生物标志物的潜力，其中突出应用集中在在肿瘤学领域。目前越来越多的科研经费注入到EV的研究中来。

长久以来，虽然已有一些研究表明目前不同储存条件对外泌体存在影响，但外泌体保存条件的标准仍未定义有统一定论。上海交通大学研究了不同pH、温度和冻融次数等储存条件对外泌体的数量变化和细胞摄取的影响并于2019年4月发表在Protein & Cell杂志上。研究人员将提取得到的外泌体等分成若干等分，每个部分在不同温度（-80℃， -20℃，4℃，37℃和60℃）下储存，或通过1-5个循环冷冻至-80℃并解冻。24小时后，进行NTA和WB检测外泌体的剩余量。

（A）通过NTA检测在不同温度下储存24小时的外泌体的相对浓度。

（B）在样品在不同条件下储存24小时后，

通过WB检测三种外泌体标记物TSG101，HSP70和ALIX的水平。

(A)(B)图的结果显示在4℃下储存的外泌体具有最高浓度。

（C）在外泌体储存于−80 °C，−20 °C及4 °C 下0，7，15及30天后，

通过WB检测三种外泌体标记物TSG101，HSP70和ALIX的水平。

（C）图中检测了在不同温度（-80℃，-20℃，4℃）下长期储存的外泌体相关蛋白的水平。ALIX，HSP70和TSG101的水平随储存时间延长而显出下降趋势，在-20℃和4℃的降解速度大于-80℃下的蛋白降解速度。在4℃下放一个月，外泌体上的标记蛋白几乎完全降解。

（D）不同的冻存次数下外泌体标记物TSG101，HSP70和ALIX的水平。

（D）图表明反复冻融会造成外泌体标记物水平的降低，其可能的机制是造成了膜的破坏。

那么问题来了，如何合适的呈现浓度和适宜保存条件之间取得理想平衡呢？

FUJIFILM Wako推出的EV-Save™ 细胞外囊泡吸附抑制剂（产品编号：058-09261）是一种新型添加剂，能有效防止外泌体吸附在塑料耗材与超滤管上而造成颗粒数的损失。研究发现，EV-Save™ 还能抑制外泌体在低温和冻融下所受到的损伤。

◆实验条件

用MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS提取COLO201细胞来源的外泌体，然后进行冻融。再进行PS Capture™ 外泌体ELISA试剂盒（抗小鼠IgG POD）（产品编号：297-79201）检测（图E），和透射电镜（TEM）分析（图F）。

（E）

（F）

◆结果

冻融后CD63信号减弱，但是添加 EV-Save™ 后这种减弱的情况得到抑制（图E）。此外，电子显微镜分析结果（图F）表明冻融导致了颗粒数明显减少，但是通过添加EV-Save™ 可以起到抑制颗粒数减少的作用。

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