细胞重编程——1. 什么是细胞重编程

 细胞重编程是将特定类型细胞转化成其他细胞类型。尤其是直接重编程体细胞，比如成纤维细胞转化成多能细胞，比如诱导性多能干细胞，或者iPS细胞。2006年，干细胞研究领域出现了革命性的发现。逆转录病毒载体过表达小鼠4种转录因子Oct4, Sox2, Klf4, 和 c-Myc (mOSKM)，将小鼠胚胎成纤维部分重编程成为诱导性多能干细胞（iPS）(Takahashi 和 Yamanaka 2006). 接下来其他实验室制备了完全重编程的小鼠iPS细胞系，这些细胞实验证实具有小鼠胚胎干细胞（ES 细胞）相当功能，能够形成嵌合小鼠(Wernig et al 2007)。相应的，重编程也可以在人细胞上操作。使用hOSKM转录因子 (Yamanaka 2007) 或者使用一套因子组合（用Nanog和Lin28代替Klf4 和 c-Myc ）(Thomson 2007)可以制备iPS。

◆重编程的发展历程

重编程技术和递送技术近年来迅速发展，现在已经可以采用多种方法递送和表达必要的重编程因子进行直接重编程。这些方法包括整合逆转录和慢病毒载体，dox诱导表达系统和减少或者去除插入到宿主细胞基因组的瞬时或者可割取的方法。最近突破性的技术是在2010年9月干细胞会议上发布的修饰合成mRNAs，可以高效的进行人成纤维细胞的重编程，基因组不会发生改变。该项学术研究加速了其他策略的发展，会有更多的研究成果。

细胞重编程——指南目录

1.    什么是细胞重编程

2.   细胞重编程概述    

3.   mRNA重编程

4.    病毒重编程

5.    产品列表 

参考文献

  [1]    Takahashi, K., Yamanaka, S. (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 126(4):663-76.

  [2]     Wernig, M., Meissner, A., Foreman, R., Brambrink, T., Ku, M., Hochedlinger, K., Bernstein, B.E., Jaenisch, R. (2007) In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature, 448(7151):318-24.

  [3]     Boland, M.J., Hazen, J.L., Nazor, K.L., Rodriguez, A.R., Gifford, W., Martin, G., Kupriyanov, S., Balwin, K.K. (2009) Adult mice generated from induced pluripotent stem cells. Nature, 461(7260): 91-4.

  [4]    Kang, L., Wang, J., Zhang, Y., Kou, Z., Gao, S. (2009) iPS cells can support full-term development of tetraploid blastocyst-complemented embryos. Cell Stem Cell 5; 135-138.

  [5]     Zhao, X.Y., Li, W., Lu, Z., Liu, L., Tong, M., Hai, T., Hao, J., Guo, C.L., Ma, Q.W., Wang, L., Zeng, F., Zhou, Q. (2009) iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. Nature 461; 86-90

  [6]    Takhashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka S. (2007) Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell, 131(5):861-72.

  [7]    Yu, J., Vodyanik, M.A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J.L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G.A., Ruotti, V., Stewart, R., Slukvin, I.I., Thomson, J.A. (2007) Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science,  318(5858):1917-20.

  [8]     Shi, Y., Desponts, C., Do, J.T., Hahm, H.S., Schöler, H.R., Ding, S. (2008) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic fibroblasts by Oct4 and Klf4 with small-molecule compounds. Cell Stem Cells, 3(5), 568-574.

  [9]    Huangfu, D., Osafune, K., Maehr, R., Guo, W., Eijkelenboom, A., Chen, S., Muhlestein, W., Melton, D.A. (2008) Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2. Nature Biotechnology, 26(11):1269-75.

  [10]   Li, W., Ding, S. (2010) Small molecules that modulate embryonic stem cell fate and somatic cell reprogramming. Trends Pharmacological Science, 31(1):36-45.

  [11]   Zhou, H., Wu, S., Joo, J.Y., Zhu, S., Han, D.W., Lin, T., Trauger, S., Bien, G., Yao, S., Zhu, Y., Siuzdak, G., Schöler, H.R., Duan, L., Ding, S. (2009) Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell, 4 (5):381-4.

  [12]   Kim, D., Kim, C.H., Moon, J.I., Chung, Y.G., Chang, M.Y., Han, B.S., Ko, S., Yang, E., Cha, K.Y., Lanza, R., Kim, K.S. (2009). Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell, 4:472-476.

  [13]    Niwa, H., Miyazaki, J.I., Smith, A.G. (2000) Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nature Genetics, 24:372-376.

  [14]    Jia, F., Wilson, K.D., Sun, N., Gupta, D.M., Huang, M., Li, Z., Panetta, N.J., Chen, Z.Y., Robbins, R.C., Kay, M.A., Longaker, M.T., Wu, J.C. (2010) A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells. Nature Methods, 7(3):197-9.

  [15]    Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. (2008) Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science, 322(5903):949–953.

  [16]    Carey, B.W., Markoulaki, S., Hanna, J., Saha, K., Gao, Q., Mitalipova, M., Jaenisch, R. (2009) Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. PNAS, 106(1):157-62.

  [17]    Wernig, M., Lengner, C.J., Hanna, J., Lodato, M.A., Steine, E., Foreman, R., Staerk, J., Markoulaki, S., Jaenisch, R. (2008) A drug-inducible transgenic system for direct reprogramming of multiple somatic cell types. Nature Biotechnology, 26(8):916-24.

  [18]    Hockemeyer, D., Soldner, F., Cook, E.G., Gao, Q., Mitalipova, M., Jaenisch, R. (2008) A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell, 3(3):346-53.

  [19]   Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. (2008) Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science, 322(5903):945-9.

  [20]   Soldner, F., Hockemeyer, D., Beard, C., Gao, Q., Bell, G.W., Cook, E.G., Hargus, G., Blak, A., Cooper, O., Mitalipova, M., Isacson,O., Jaenisch, R. (2009) Parkinson’s disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors.  Cell, 136(5):964-77.

  [21]    Zhou, W., Freed., C. (2009) Adenoviral Gene Delivery Can Reprogram Human Fibroblasts to Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells 27(11):2667 – 2674.

  [22]    Woltjen, K., Michael, I.P., Mohseni, P., Desai, R., Mileikovsky, M., Hämäläinen, R., Cowling, R., Wang, W., Liu, P., Gertsenstein,M., Kaji, K., Sung, H.K., Nagy, A. (2009) PiggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature, 458(7239):766-70.

  [23]    Yu, J., Hu, K., Smuga-Otto, K., Tian, S., Stewart, R., Slukvin, I.I., Thomson, J.A. (2009) Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science, 324(5928):797-801.

  [24]    Nakagawa M., Koyanagi M., Tanabe K., Takahashi K., Ichisaka T., Aoi T., Okita K., Mochiduki Y., Takizawa N.,Yamanaka S. (2008) Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nature Biotechnology, 26(1):101-6.

  [25]    Warren, L., Manos, P.D., Ahfeldt, T., Loh, Y.H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P.K., Smith, Z.D., Meissner, A., Daley, D.Q., Brack, A.S., Collins, J.J., Cowan, C., Schlaeger, T.M., Rossi, D.J. (2010) Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency andDirected Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7:618.

  [26]    Yakubov, E., Rechavi, G., Rozenblatt, S., Givol, D. (2010) Reprogramming of Human Fibroblasts to Pluripotent Stem Cells using mRNA of Four Transcription Factors. Biochem Biophys Res Commun. 394:189.

什么是外泌体

金泽大学医学系免疫学 教授

華山　力成

　　近年来，细胞外囊泡（EV）相关的研究正加速发展。2011年每年有约200篇相关论文发布，但2016年一年间有1000篇以上的相关论文发布，论文内容涉及各种生理功能和病理症状等方面。EV大致可分为核内体来源的外泌体和细胞质膜来源的微囊泡，但即便是用提取纯度最高的超速离心法也难以将二者完全分离，所以简单地将10,000×g离心后上清中的EV称为小EV（主要是外泌体）^1）。外泌体是由各种细胞分泌的小型膜囊泡（直径30~100nm），存在于大多数体液（如血液、尿液、髓液等）和细胞培养液中。外泌体是由脂质双层膜包被的膜囊泡，产生于称为多囊泡体的细胞外囊泡中，多囊泡体通过与细胞膜融合将外泌体释放到细胞外。外泌体含核内体来源的蛋白质（如ESCRTs）、细胞内运输相关蛋白（如RabGTPase等）及细胞膜来源蛋白（如CD63, CD81等）等各种内分泌细胞来源的蛋白和RNA，同时还含有分泌细胞膜来源和内体膜来源的脂质（如胆固醇和鞘磷脂等）^2）。多年来，外泌体被认为参与无用的细胞内含物质的释放。但是近年来，外泌体在活体内作为运载脂质、蛋白质、RNA等细胞间信息传递的新型媒介而倍受瞩目。随着其功能在生理及病理功能的阐明，外泌体在临床应用的相关研究中，特别是诊断治疗、生物标记的开发也迅速发展起来。

　　现在，外泌体研究几乎涉及所有的研究领域（免疫、神经系统、癌症、内分泌、循环系统等）。例如，免疫细胞来源的外泌体含有抗原肽/MHC复合体和可能控制着免疫细胞间抗原信息的交换、免疫细胞活化/非活化等各种免疫应答机制的各种抗原^3）。外泌体在神经系统中与神经回路的控制相关^4），同时各种神经退行性疾病的致病蛋白还可以通过外泌体释放到细胞外并传递到其他细胞，与病情发展密切相关^5）。 癌细胞释放的外泌体含有许多与血管新生和免疫逃逸相关的分子，构建适合癌细胞生长的微环境，促进癌细胞的发展^6）。另外，癌细胞来源的外泌体上粘着分子的表达形式决定着癌症向器官的转移途径^7）。最近，有报告指出脂肪细胞释放的外泌体对肝脏的遗传基因表达有控制作用^8）。许多病毒利用外泌体的产生路径感染细胞，受病毒感染的细菌和寄生虫通过外泌体控制其他受细胞感染的细菌、寄生虫的活动^9、10）。

　　上述这些功能几乎都是通过细胞分泌到外泌体中的分子引起的。其中已发现外泌体内含有分泌细胞来源mRNA和miRNA，外泌体与细胞间遗传基因表达信息的水平传播相关性倍受瞩目^11）。这些RNA被外泌体的脂质双层膜所保护，不会被核糖核酸酶所分解，可以在血液和体液中稳定存在。被靶细胞吞噬的外泌体通过与内体膜融合，将RNA释放到靶细胞的细胞质中。释放出来的mRNA翻译为蛋白质，但miRNA抑制目的基因的翻译，因此外泌体在靶细胞内控制基因的表达。外泌体的蛋白质有数万种，mRNA、miRNA的种类有数千种以上，它们的结构除了受细胞来源不同的影响，还受到细胞状态不同的影响。另外，外泌体中这些物质的结构与它们在分泌细胞内的结构不同，所以可能存在一种外泌体特异蛋白和mRNA/miRNA在外泌体内选择性积累的机制。这种特异性可将外泌体内的RNA作为生物标记，更进一步作为治疗开发方法的靶点。外泌体中的mRNA一旦被靶细胞吞噬，能够引起这个细胞内的功能性蛋白的表达，但外泌体中多数的miRNA是前体而非功能性miRNA，这些miRNA起着何种生理性意义，学者们正在研究。由于外泌体含有各种蛋白质、RNA和脂质，研究人员正将其进行细胞分类，建立数据库（ExoCarta）。此外，在世界各地分别进行着运用蛋白质组学、转录组学和系统生物学的大规模分析工作，而FunRich的EV plugin作为一种通用的分析手段已被公布出来。今后，在推进外泌体研究方面，各领域的研究人员信息共享至关重要。

◆运用外泌体进行治疗和诊断的功能开发

　　随着外泌体的功能逐渐被发现，近年来，应用这些功能的治疗法也在被开发出来。例如，血液中的成纤维细胞所释放的外泌体，可以促进角质形成细胞的移动和增殖以及血管新生来促进伤口愈合。有报导指出，外泌体内miRNA参与促进血管新生、抗炎症性和促进胶原蛋白沉淀等一系列过程^12）。从癌症患者树突状细胞释放的外泌体中，含有各种癌症细胞来源的蛋白质，可以强化杀伤性T细胞对癌症细胞的特异性反应。利用此功能的抗肿瘤免疫疗法，目前正处于初期临床研究阶段^13）。另外，科学家也尝试利用外泌体的抑制发病机制功能。例如，类风湿关节炎患者的滑膜成纤维细胞所释放的外泌体，高浓度集聚诱导细胞死亡的TNF-α，可使类风湿关节炎恶化^14）。通过上述介绍可以知道癌症细胞来源的外泌体含有与癌症进展相关的分子，神经细胞来源的外泌体含有与神经退行性疾病相关的分子，因此，通过抑制或去除这些外泌体，有希望抑制疾病发生。随着今后的研究发展，外泌体功能逐步清晰，并扩大临床应用，有望将外泌体应用在各种疾病治疗上。甚至可尝试利用外泌体将siRNA和抗癌药剂等运输到目标细胞中。各种细胞粘着分子在外泌体膜表面表达，由其决定外泌体被运输往哪一种细胞，期望开发利用该特征的新型DDS^15）。外泌体在体液中十分稳定，同时外囊泡所含的蛋白质和RNA被外泌体的脂质双层膜所包被也不会分解。另外在从体液中提取外泌体后，体液可长期稳定保存，因此外泌体有望成为临床检测的新型疾病生物标记。外泌体与各种疾病的相关性被检测出，特别是血液中释放的癌细胞来源的外泌体，其与正常细胞来源外泌体在结构分子上的差异倍受瞩目，并作为癌症早期诊断技术，应用于与癌症进展相关的研究^16）。甚至人们期望将尿液中的外泌体作为肾脏、前列腺疾病、膀胱疾病的新型诊断标记，髓液中的外泌体作为脑内肿瘤和神经退行性疾病的新型标记物。

◆外泌体研究的课题和展望

　　已经有许多关于外泌体作用的报导，根据这些现象实验中，从体液和培养上清中高纯度提取的高纯度外泌体，在活体内是否真的能发生作用尚未能确定。确认外泌体生理作用的唯一方法就是明确外泌体的释放机制，通过促进或抑制释放机制，分析会引起何种生理作用，这是进一步研究的发展方向。甚至活体内的外泌体动态（哪个外泌体迁移至何处）也会成为今后需要努力研究的重要课题。

　　目前，提取外泌体的方法主要有超速离心法、PEG沉淀法，但这些方法混有非常多的杂质，必须慎重分析得到的是否是外泌体。超速离心法存在操作繁杂、回收量不稳定，不能用于定量分析、必须使用昂贵的超速离心机、无法进行多样品分析等问题。因此外泌体研究相对困难，需要尽快开发操作简单、可提取高纯度外泌体的技术。因此，日本和光着眼于巨噬细胞的外泌体受体Tim4蛋白，制备Tim4细胞外域与磁珠结合的“Tim4磁珠”^17）。Tim4通过磷酯酰丝氨酸（PS）法特异性结合Tim4蛋白和磁珠，再经过含有EDTA的洗脱缓冲液进行分离，提取高纯度的完整外泌体。实际上，用PS亲和法提取的人白血病细胞释放的外泌体，其纯度与超离心法和PEG沉淀法提取外泌体做比较， PS亲和法提取的外泌体，其蛋白特异性检测可高出10~100倍以上，几乎没有混入外泌体以外的蛋白，回收量高，操作重复性好。结果表明，PS亲和法可以检测到许多目前为止都无法检测的外泌体蛋白质和RNA。应用Tim4的外泌体强结合能力，可用ELISA或FACS高灵敏度定性检测、定量分析外泌体。以前无法用超速离心法提取的微囊泡，也通过运用PS亲和法实现高纯度提取。本指导书中对该技术进行详细说明，这项技术的有用性今后将受到世界各方评价，有望在外泌体和微囊泡生理功能的分析研究上起重大贡献。

　　外泌体的检测和提取还遇到一个困难即：对各种外泌体的分类。研究人员尚未统一定义以何种方法提取的细胞外囊泡可以称之为外泌体，给实验数据的分析和重复性确认带来困难。近年，随着国际细胞外囊泡协会的成立、世界性研究者研讨会的举办，提案MISEV指南作为国际标准，计划或已经开始进行EV研究的科学家请务必阅读这些方针^18、19）。另外，建立记录各论文实验条件的数据库也可作为规避混乱的方法之一^20）。一方面，随着EV研究倍受世界瞩目，各国启动了大型研究项目。美国启动NIH战略性大型项目（Extracellular RNA Communication），国际权威性学会——Gordon和Keystone Symposia也从2016开始成立会议小组。受到欧洲药物研究开发公司“创新药物倡议组织（IMI）”的支持推进的CANCER-ID项目，也包含EV研究在内。2017年日本选定了EV研究为文部科学省研究开发战略的目标之一，期待会加速今后的研究发展。无论如何，今后EV研究的根本就是必须有强有力的研究方法和技术，而PS亲和法有望成为其中之一。

◆参考文献

PS亲和法外泌体提取试剂盒

　　MagCapture^™ Exosome Isolation Kit PS提取高纯度完整状态的外泌体。

　　外泌体是各种细胞外泌的直径在30-100nm之间的膜囊泡。因外泌体内含mRNA、microRNA等核酸和蛋白质对相邻细胞具有交换信息的功能。作为细胞间信号传导的通讯工具和作为癌等各种疾病的生物标记话题比较热门^1、2）。近些年关于外泌体研究很广泛，但是关于外泌体相关的实验技术，关于需要改进的课题存在很多。

　　例如，外泌体提纯方法中，超速离心法和聚合物沉淀法（市售试剂盒）混入多种杂质，给后续实验产生了许多障碍。抗体亲和法和密度梯度离心法，虽然可以提取到高纯度的外泌体，但不能提取完整外泌体，无法分析外泌体具有的生理功能，也是两种提取方法的问题所在。而免疫印迹法（WB）和Elisa检测法作为被广泛应用的外泌体检测的一般方法，又存在检测时需使用大量外泌体和难以检测到低表达水平的标记蛋白。

　　为了解决外泌体实验遇到的上述的各种问题, Wako 研发出MagCapture™外泌体提取试剂盒PS（MagCapture™  Exosome Isolation Kit PS）提取高纯度细胞外囊泡。

　　外泌体膜含有分泌细胞源的蛋白和脂质，众所周知磷脂酰丝氨酸（PS）在活细胞通过翻转酶作用导向细胞膜内侧，暴露在外泌体膜外侧^3）。另外，T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing protein 4（Tim4 通过巨噬细胞进行细胞凋亡的吞噬受体）蛋白通过细胞外域IgV域与含有钙离子的PS结合^4）。

　　基于上述知识，我们利用Tim4固化磁珠，在钙离子存在下捕捉培养上清和血清等样品中的外泌体，再添加螯合剂洗脱外泌体，这种外泌体纯化方法是和金泽大学医学系免疫学华山教授共同开发，并取得了成功。^5）这是迄今为止取代黄金标准超速离心法的新型外泌体纯化方法。

◆参考文献

MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 PS

　　MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS采用磷脂酰丝氨酸（PS）亲和Tim4蛋白的PS亲和法，可方便获得高纯度的外泌体和其他来自细胞培养基和体液的EVs。提取的完整外泌体和其他EVs可用于不同实验：电镜分析，纳米粒子追踪分析，EVs的操作和分析等。

【特点】

●　可提取高纯度的完整外泌体

●　可从血清、血浆、尿液等样品中提取外泌体

●　重复性高，回收量稳定

●　操作简单，可处理多个样品（无需超速离心）

是什么塑造了我们？

Heather Brown

◆受伤的大脑会改变我们吗？

是什么创造了我们不同的个性还有性格？历史上古埃及人将这些特征归因于我们的心脏。然而，今天我们都明白，大脑才是我们的驱动力（Ziskind et al., 2004）。错综复杂的神经连接存储了我们生活中的每一个记忆和片段，以塑造出我们独有的个体。多年来神经科学领域的论文也证明了这一理论，但是在脑损伤的背景下这个理论就变得有问题（Simon et al., 2020, Valk et al., 2020, Smith et al., 2019）。换句话说，当我们的手臂受伤时，我们的个性和性格没有改变，还是同一个人。然而，当我们的大脑受伤时，我们的个性和性格可能会永远改变。

◆什么是神经变性？

进行性脑损伤的一个例子是神经变性。神经变性的特征是中枢或外周神经系统受破坏，可由多种疾病引起。神经变性对患者及其家人来说是毁灭性的。虽然许多神经退行性疾病无法治愈，但早期干预可以大大减缓患者的认知能力下降速度，并提高他们的生活质量。然而，早期干预很复杂，也鲜有进行，因为在神经退行性疾病的早期阶段，也称为轻度认知障碍 （MCI），我们没有用于明确诊断的生物标志物。此外，由于许多疾病之间的临床特征重叠，识别出足以区分各种神经退行性疾病的生物标志物一直是一项挑战（Ashton et al., 2020）。因此，为开发特定、可靠和可获取的生物标志物作为确定诊断和早期干预的有力工具，以改善神经退行性疾病的患者及其亲属的生活质量，了解导致这些神经退行性疾病病理因素之间的分子差异至关重要

阿尔茨海默病（AD）是一种困扰世界的神经退行性疾病。阿尔茨海默病的病理标志是大脑中淀粉样蛋白β（Aβ）斑块的聚集，这些斑块是最终破坏大脑功能的蛋白质聚集体。阿尔茨海默病患者会从早期阶段有正常的认知能力，发展为明显的脑功能障碍。神经退行性疾病的早期阶段，也被称为轻度认知障碍（MCI），表现为认知能力的差异、单个或多个认知领域的损伤（超出患者年龄和教育的预期）、能保持功能性能力的独立性，并且没有影响社交或职业能力。轻度认知障碍随后会发展为阿尔茨海默病，使患者出现了认知缺陷，最终损害患者生活自理能力(alz.org)。其他对研究有重要意义的的神经退行性疾病有帕金森病（PD）、额颞叶痴呆（FTD）和路易体痴呆（DLB），这些疾病的特征也是神经系统中异常蛋白的聚集。它们通常被称为聚集病（aggregopathies），意味着它们表现出以下六种必需蛋白质中的一种或多种的聚集：Aβ、朊病毒蛋白（PrPSc）、tau、α-突触核蛋白、TAR DNA结合蛋白43（TDP43）或融合在肉瘤中（FUS） (Ashton et al., 2020)。

◆目前检测神经退行性疾病的方法和挑战是什么？

目前对这些疾病的诊断方法往往不够灵敏，无法进行早期检测，因此到确诊的时候，已经发展为经过数十年的显著神经变性。除了基因检测（例如，APOE基因中的常染色体显性突变），临床医生不得不依赖患者关于认知能力下降的报告（但这不可靠并且不稳定），以及昂贵的侵入性检测方法来诊断。 例如，通过PET扫描进行Aβ成像，其中将放射性示踪剂（如Florbetapir （18F））注射到患者体内并与人脑中的Aβ结合，以便在成像时看到。然而，这些PET扫描并不一定能确诊，因为多个神经退行性疾病的PET扫描结果看起来是相似的，因此根据患者的具体疾病来进行靶向治疗会比较困难。患者脑脊液（CSF）的Tau或淀粉样蛋白检测也是一种诊断方法。然而提取脑脊液，具有一定的侵入性。此外，这些生物标志物仍然存在于各种神经退行性疾病中，导致医生不能确定诊断结果。总之，寻找下一代生物标志物来检测神经退行性疾病的发作并区分病理，是科学和医疗保健的重要的一步。

◆什么是下一代生物标志物，它们如何提供帮助？

鉴于当前生物标志物的侵入性和模糊性，更特异性识别和更容易获得的生物标志物对于神经退行性疾病的早期干预和治疗十分重要。例如，对于识别早期患者的生物标志物来说，基于血液的生物标志物会更易获得。其中一种标志物是被称为神经丝轻链（NFL）的蛋白。当神经细胞受损时会释放NFL，可在脑脊液和神经退行性疾病患者的血液中找到。与健康人群相比，患有前驱性阿尔茨海默病和家族性阿尔茨海默病的个体的NFL水平升高（Ashton et al., 2020）。此外，在超灵敏免疫测定截断型淀粉样前体蛋白（APP ΔC31）、Aβ和总tau/磷酸化tau的进展表明，基于血液的生物标志物筛查是一种识别阿尔茨海默病的实用手段。

例如，由于截断型蛋白APP ΔC31是阿尔茨海默病中导致神经元死亡的因素之一，Poksay 等人(2017)使用了Enzo的APP ΔC31 ELISA试剂盒（新商品化的APP ΔC31的定量试剂盒），用于测量患者血浆中的这种蛋白质生物标志物，并测试小分子抑制剂以降低受阿尔茨海默病影响的个体中的APP ΔC31水平。为进一步研究，Enzo对 APP ΔC31 ELISA试剂盒进行了验证，该试剂盒能够以高特异性和大动态范围对细胞裂解物和脑脊液中APP ΔC31进行定量（图1A、B）。这些数据有望成为早期检测和干预的潜在方法。此外，已使用抗体检测到循环磷酸化 Tau 蛋白，如使用[pSer262] Tau 多克隆抗体，可检测在丝氨酸 262 位点磷酸化的 Tau 蛋白，该蛋白是阿尔茨海默病的标志物(Liu et al., 2005)。另一个值得注意的基于血液的生物标志物是Aβ42/Aβ40的比率，其可能有助于区分和诊断神经退行性疾病。临床数据表明，在阿尔茨海默病和阿尔茨海默病前驱期患者中，这一比率要低于健康对照组（Ashton et al., 2020）。

图1 

使用APP ΔC31 ELISA试剂盒标准品制作的标准曲线，具有较大的动态范围（A）。重组实验标准品与各种基质之间加标APP ΔC31后的平行性对比（B），表明该试剂盒有着较高特异性和样品回收率。

虽然下一代生物标志物（如上述基于血液的生物标志物）开始出现并用于临床，但需要进一步研究以验证当前基于血液的生物标志物，并开发和验证新的生物标志物，以用于早期干预和诊断中。

◆Enzo 如何支持下一代生物标志物和神经病学研究的发展？

数十年来，Enzo Life Sciences一直是您重要的科研合作伙伴。Enzo拥有强大的产品线来支持您的神经学研究，让您获得高质量的实验数据以助您研究的一臂之力。Enzo提供多种工具用于研究前沿生物标志物、神经系统疾病和退化。下表为对应各种疾病的Enzo可提供的产品：

◆相关产品

※ 本页面产品仅供研究用，研究以外不可使用。