DNA特异性细胞核实时成像试剂
NucleoSeeing ＜Live Nucleus Green＞
NucleoSeeing是与DNA特异性结合并发出绿色荧光的实时成像用细胞核染色试剂。不仅是动物细胞和组织，拟南芥的叶细胞中也显示出高S/N比，并可很好的观察活细胞中细胞核动态。另外，还可用作细胞核pH sensor。
※本产品基于名古屋工业大学的研究成果商品化而成。
※本产品仅供科研使用。严禁用于科研以外用途。
使用了NucleoSeeing的各种样本的染色案例
将HeLa细胞（左），拟南芥表皮细胞和保卫细胞（中），小鼠脑海马切片培养（右）活细胞成像后进行观察。详情请参考各个案例的数据。
◆活细胞的细胞核成像
MEMO
细胞核作为DNA的储存库负责细胞分裂和控制基因表达，是细胞中最重要的细胞器之一。因此细胞核动力学的动态实时成像就成为了非常重要的课题。从以前开始就开发了各种核染色试剂，虽然核酸应答性的蓝色荧光色素Hoechst系列和DAPI被广泛运用，但由于这些蓝色荧光素使用紫外线作为激发光，光毒性强，存在不适用于活细胞成像的问题。最近，虽然开发了一些适用于活细胞的核染料，如绿色和红色荧光色素，但是化合物的细胞毒性和核染色的特异性仍然存在问题。
NucleoSeeing是名古屋工业大学的筑地真也教授等人开发的DNA特异性绿色荧光化合物，可以在细胞培养，组织培养以及拟南芥叶等的植物细胞中进行活细胞成像。本产品细胞毒性低，DNA特异性显示高S/N比，以及优异的细胞核染色性能。也可用于观察固定细胞，应用灵活。另外，由于其拥有特殊的pH依存性荧光特性，还可以用作细胞核特异性的pH sensor。近年，在细胞核内pH重要性的研究中，还可以期待本产品作为核内pH检测的专用试剂。
各种细胞核染料的比较参数
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染色试剂名称
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光特性
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化合物的物性
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观察方法
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检测波长
激发/荧光（nm）
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荧光色
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光毒性
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核特异性
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细胞膜
渗透性
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细胞毒性
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活细胞
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固定细胞
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NucleoSeeing
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488 / 520
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绿
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无
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✔
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✔
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无
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✔
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✔
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Hoechst
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350 / 461
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蓝
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有
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✔
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✔
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有
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✔
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✔
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DAPI
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350 / 461
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蓝
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有
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✔
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×
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不明
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×
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✔
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X公司产品
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485 / 498
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绿
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✔
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△
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✔
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不明
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✔
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✔
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Y公司产品
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646 / 680
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红
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✔
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✔
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✔
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有
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✔
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✔
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◆原理
NucleoSeeing是细胞膜渗透性的绿色核染色试剂，由绿色荧光色素和DNA特异性结合tag组成。本产品在DNA不存在时显示折叠构造，虽然有消光状态，但与DNA结合时构造发生改变，发出绿色荧光。由于NucleoSeeing摄入细胞内后与DNA结合时发出绿色荧光，因此可以特异性观察细胞核。
◆特点
● 仅在与DNA结合时发出绿色荧光，显示高S/N比。由于在培养基中会消光，因此在添加了培养基的状态下也可以高灵敏度地进行观察
● ※想要提高灵敏度，则建议染色后更换培养基后再进行观察。
● 激发光/发射光波长：488 nm/520 nm
● 和传统的Hoechst等试剂相比，几乎没有发现细胞毒性。
● 不仅仅是活细胞成像，还可以染色固定细胞，活细胞成像后再固定细胞进行观察，也可以用于免疫染色实验。
● 无论是动物来源的细胞和组织培养，还是植物细胞（拟南芥叶细胞），都可以进行高S/N比的核染色。
● 观察植物细胞时，不受叶绿体来源的自身荧光（Em：>615 nm）的影响，可以仅将细胞核可视化。
● 能够可逆性染色。培养基更换12~24小时后，染料几乎全部被排出细胞外。
● 由于可以看见pH依赖性的荧光强度的变化，所以在pH 6~8之间，可以通过2个波长的荧光强度比（Ex 405 nm, Em 520 nm / 460 nm），
作为细胞核内的pH sensor使用。
◆应用
● 动物来源培养细胞的活细胞成像
● 植物细胞的活细胞成像
● 免疫染色中的细胞核染色
● 细胞核内pH sensor（pH 6~8）
◆原著论文
※ 本产品NucleoSeeing是以下论文中的hoeAc2FL。
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1.
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Nakamura, A., et al., Chem. Commun., 50, 6149～6152 (2014)
"Hoechst tagging: a modular strategy to design synthetic fluorescent probes for live-cell nucleus imaging."
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2.
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Ueda, M., et al., ACS Cent. Sci., 3 (5), 462～472 (2017)
"Noncanonical function of a small-molecular virulence factor coronatine against plant immunity: an in vivo raman imaging
approach."
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3.
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Nakamura, A. and Tsukiji, S., Bioorg. Med. Chem. Lett., 27 (14), 3127～3130 (2017)"Ratiometric fluorescence imaging of
nuclear pH in living cells using hoechst-tagged fluorescein."
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◆应用实例
DNA应答性的荧光特性和细胞核特异性染色
左：NucleoSeeing仅在DNA存在时显示出强的绿色荧光。激发光488 nm。
右：在活细胞中，与DNA特异性结合的Hoechst33342（蓝）和NucleoSeeing（绿）进行共染色的结果，显示出高度的一致性。
细胞毒性
作为蓝色核染色试剂被广泛使用的Hoechst33342和NucleoSeeing，利用MTT法确认其细胞毒性。Hoechst在5 μM时观察到了显著的细胞死亡，而NucleoSeeing在5 μM时还未观察到细胞毒性。
可逆性染色
为了评价Hoechst33342和NucleoSeeing的细胞滞留性，分别用1 μM两种试剂处理15分钟后，更换培养基，去除剩余的试剂，观察24小时荧光强度的变化。Hoechst33342在24小时后依然维持80%的荧光强度，显示出不可逆性，与之相对NucleoSeeing随着时间推移，荧光强度逐渐减弱，12小时以后几乎全部排出。因此，NucleoSeeing可以作为可逆性的核染色试剂使用。
各种培养细胞的核染色
添加1 μM的 NucleoSeeing 至各种培养细胞的培养基中，染色15分钟后，更换培养基观察活细胞，无论哪种细胞都观察到了核特异性的信号。
小鼠脑（海马）切片培养组织的染色案例
添加20 μM 的NucleoSeeing至小鼠脑海马切片培养组织的培养基中，染色15分钟后，更换培养基在未固定的条件下进行观察。
固定细胞的染色案例
左：用4%多聚甲醛固定处理HeLa细胞后，用PBS清洗细胞，添加1 μM的 NucleoSeeing染色15分钟。染色后，清洗并观察。
右：添加5 μM 的NucleoSeeing染色15分钟，用4%多聚甲醛固定细胞并进行观察。
右：※虽然也可用甲醇进行固定，但信号可能会减弱。
拟南芥叶的保卫细胞染色案例
用20 μM 的NucleoSeeing处理拟南芥叶的切片60分钟后，清洗切片进行观察。激发光为488 nm时，在绿色荧光范围490~555 nm内观察保卫细胞的细胞核，615 nm以上波长范围中观察到叶绿体来源的自身荧光。通过使用本试剂，可以在观察时区分叶绿体的自身荧光和细胞核荧光，期待本品可作为植物细胞的核动态成像试剂使用。
※拟南芥叶的保卫细胞的核染色是由名古屋工业大学的筑地教授等人和东北大学上田实教授等人共同研究发现的成果。
Ueda, M., et al., ACS Cent. Sci., 3 (5), 462～472 (2017)
"Noncanonical function of a small-molecular virulence factor coronatine against plant immunity: an in vivo raman imaging approach."
拟南芥叶表皮细胞的染色案例
用20 μM的 NucleoSeeing处理拟南芥叶的切片60分钟后，清洗切片进行观察。确认表皮细胞的核特异性染色。
◆使用NucleoSeeing作为核内pH sensor
细胞核有着由外膜和内膜这两层脂质双分子层膜构成的核膜这种独特结构，与细胞质分隔开来。细胞核内和细胞质之间的物质交流需要通过细胞核孔进行，但学者们认为细胞核内的环境和细胞质的环境是不同的。近年，有学者提出核膜中存在核膜特异性质子泵（H+-ATPase），在细胞核和细胞质之间产生质子梯度。虽然可以期待通过生理现象变化来检测细胞核内的pH值，但是至今还没有开发出十分理想的试剂。
名古屋工业大学筑地教授等人证明NucleoSeeing具有pH依赖性荧光特性，可以作为细胞核传感器使用。NucleoSeeing作为细胞核染色试剂，一般在激发光480 nm/荧光520nm的范围使用，但是在激发光405 nm时使用的话，在460 nm以及520 nm左右的荧光会依赖pH值发生变化。通过检测激发光405 nm时460 nm和520 nm的荧光强度比（F520 / F460），观察pH5.5～8.5之间的S形曲线。利用这个原理，就可以评估细胞核内的pH值。
■ 原著论文
Nakamura, A. and Tsukiji, S., Bioorg. Med. Chem. Lett., 27 (14), 3127～3130 (2017)
"Ratiometric fluorescence imaging of nuclear pH in living cells using hoechst-tagged fluorescein."
◆NucleoSeeing用作细胞核内pH sensor的原理和特点
（参考数据）in vitro中NucleoSeeing的pH依赖性荧光特性
左：在NucleoSeeing的激发波长405 nm时荧光光谱和pH依赖性。在pH5.5~8.5之间，460 nm和520 nm附近的荧光强度随着pH值降低而增强。
右：在各pH值中，460 nm和520 nm的荧光强度F（激发波长405 nm）和荧光强度比(F520 / F460)。
<注>NucleoSeeing针对活细胞用的细胞膜渗透性进行了优化，摄入细胞内以后，被酯酶水解并转化为活性本体。本数据是为了验证使用了化学合成的活性本体（NucleoSeeing的水解产物）进行in vitro获得的数据。请注意直接使用NucleoSeeing进行in vitro不可能重现本数据。
◆在in cellulo 中使用NucleoSeeing观察细胞核内pH
用NucleoSeeing染色培养细胞（HeLa细胞）后，用含有K+ / H+离子载体Nigericin * 的pH buffer培养后，用共聚焦显微镜观察在激发光405 nm时的荧光强度比（FFluorescein / FHoechst）
左：各pH值的荧光观察图像
右：定量结果分析与in vitro相同，可以观察到pH依赖性和荧光强度比的对应关系，并且预估生理性（未添加Nigericin）的核内pH值为7.4。
* Nigericin是代表性的K+ / H+离子载体，在细胞外溶液的pH值和细胞内pH值一致时使用。
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