组织透明化试剂Q&A ver1.0
Tissue clearing reagent Q&A ver1.0
Q:组织透明化的原则
A:组织透明化通常是按下面的步骤进行的:
A(a)固定 (b)透化 (c)脱色 (d)折射率匹配
Q:组织透明化的优势
A:目前大多数可用的透明化技术,都是通过编码荧光报告蛋白或者用荧光标记抗体进行后标记,从而可视化组织中特定的蛋白。组织透明化成为
A:了具有单细胞分辨率的组织3D成像中重要的一环。
Q:透明化技术的比较
A:下面是水性的透明化技术。
A:SeeDB(基于果糖的方法)在一些应用中有一定优势。因为SeeDB不含去垢剂,所以对于透明化 DiI(细胞膜红色荧光探针,一种神经示踪剂)标记的样品和使用光电关联显微镜(CLEM)的情况下,SeeDB 有着一定优势。另外 SeeDB 会产生自体荧光,有时候会对辨认未标记的神经元结构(如神经毡)起着一定帮助。
A:SeeDB2 是为使用高 NA 物镜的高分辨率成像而优化的技术;因此,当处理较大的组织时,CLARITY 或者 CUBIC 会是更好的选择。
Q:切片厚度的最大值和最小值?
A:您应该根据您的物镜的 WD(工作距离)来决定切片的厚度。我们建议切片的厚度不要超过 3 mm。对于十分薄且脆弱的样品,我们建议使用
琼脂糖包埋。使用 CUBIC,可以让全器官、全身透明化和使用 LSFM 的快速 3D 成像具有可重复性。
Q:试剂盒成分
A:具体如下:
A:1. SCALEVIEW-S试剂盒(299-79001)适用于20份1-2 mm的切片样品
A:A:1) SCALEVIEW-S0——100 mL
A:A:2) SCALEVIEW-S1——100 mL
A:A:3) SCALEVIEW-S2——100 mL
A:A:4) SCALEVIEW-S3——100 mL
A:A:5) SCALEVIEW-S4——100 mL
A:A:6) SCALEVIEW-SMT——100 mL
A:2. SCALEVIEW-S试剂盒(290-80801)适用于20-30份1-2 mm的切片样品。
A:A:1) SCaleCUBIC-1 Solution——250 mL
A:A:2) SCaleCUBIC-2 Solution——250 mL
A:A:3) Mounting Solution 1——40 mL
A:A:4) Mounting Solution 2——40 mL
A:3. SeeDB试剂盒(299-79901)适用于20-30份1-2 mm的切片样品。
A:A:1) SeeDB:20w/v% Fructose Solution——50 mL
A:A:2) SeeDB:40w/v% Fructose Solution——50 mL
A:A:3) SeeDB:60w/v% Fructose Solution——50 mL
A:A:4) SeeDB:80w/v% Fructose Solution——50 mL
A:A:5) SeeDB:100w/v% Fructose Solution——50 mL
A:A:6) SeeDB——50 mL
A:4. SeeDB2试剂盒(294-80701)适用于20-30份1-2 mm的切片样品。
A:A:1) Saponin(皂角苷)——5 g
A:A:2) SeeDB2G solution——50 mL
A:A:3) SeeDB2S solution——50 mL
A:A:4) PBS——50 mL
Q:样品的保存
A:SCALEVIEW-S处理的样品应在室温下保存2至3周。您可以在2至3周内观察SCALEVIEW-S透明化的样品中的荧光信号。
A:CUBIC处理的样品应在室温下保存1周。您可以在1周内观察CUBIC透明化的样品中的荧光信号。
A:SeeDB2G处理的样品应在冰箱中保存1年,而SeeDB2S处理的样品则可在室温下保存1年。您可以在1年内观察SeeDB透明化的样品中的
荧光信号。
Q:抗体的荧光标记
A:应在进行透明化前就进行抗体的荧光标记。
Q:适用于SCALEVIEW-S的显微镜
A:SD-OSR(Olympus)
A:FV-OSR(Olympus)
Q:适用于CUBIC的显微镜
A:SD-OSR(Olympus)
A:FV-OSR(Olympus)
A:Zeiss Lightsheet Z.1(Carl Zeiss)
Q:适用于SeeDB2的显微镜
A:Confocal(最好使用高NA的油浸镜头)
A:STED(Leica Microsystems)
A:SR-SIM(Carl Zeiss)
A:SD-OSR(Olympus)
A:FV-OSR(Olympus)
A:Airyscan(Carl Zeiss)
A:HyVolution(Leica Microsystems)
A:Two-photon(最好使用复合浸没镜头)
A:Confocal(最好使用高NA的甘油浸镜头)
A:Light-sheet DLS(Leica,最好使用定制镜面的设备)
Q:重构
A:对于定量用途,我们建议使用Neurolucida系统(MBF)。我们同样测试了VAST Lite用于成像用途时的表现。重构时也可以使用开源软件。
例如,Vaa3d可以处理大量的拼接图像的数据。
Q:物镜推荐
Q:其他物种?其他器官?
A:对于昆虫样品和鱼类样品,建议选择CUBIC。
A:昆虫相关文献:Ohuma.et al.: Fish Pathology, 52(2), 96(2017).
A:鱼类相关文献:Konno and S.Okazaki .: Zoological Letters, 4:13(2018).
对于多细胞球状体,选择SCALEVIEW-S会更好。
https://www.nature.com/articles/s41598-018-29169-0