Whatman 沃特曼 Extractor EB回收系统
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Whatman 沃特曼 Extractor EB回收系统 10448030, 10448031
详细描述
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Whatman 溴化乙啶（EB）废液减量系统
Extractor? EB减量回收系统是一套从凝胶染色液中快速去除EB的一步过滤装置。
Extractor的一次性使用元件中含有活性炭基质，能够快速、方便的从电泳缓冲液中除去>99%的EB。每套装置可以处理10Lde凝胶染色液。过滤后的去污染的溶液可以安全的排放。
Extractor漏斗式设计可与大多数实验室标准烧瓶和玻璃瓶（瓶颈为33~45mm）配套使用，配备的盖子可方便不用时存放，聚丙烯材质容器抗化学有机物。装置还包括玻璃纤维预滤层，可用于除去凝胶颗粒和其他杂质，以过早避免堵塞活性炭滤层。
富士胶片和光纯药株式会社 生命科学研究所 福地大树
◆前言
包含疫苗在内的大部分生物药都是使用培养细胞或大肠杆菌生产的，有研究者指出，通过这种方式生产的原料药、制剂可能会残留着宿主细胞来源的DNA。不可否认，宿主细胞或病毒来源的致癌基因很可能会通过这些残留DNA转运过来，或引起病毒DNA感染事件。因此，残留DNA的定量检测是生物制药和其工艺验证中不可或缺的一部分。
有报告建议生物药中每剂量残留DNA的含量不超过100 pg[1] ，不仅是欧美地区，其他国家也愈发认为必须将定量检测宿主细胞来源的残留DNA作为质量检测项目之一。而检测这种痕量残留DNA，则需要从样品中以高回收率提取痕量残留DNA。
本文将介绍本公司销售的DNA Extractor® Kit —— 一款可用于此类痕量残留DNA检测的DNA提取试剂盒。
◆关于DNA Extractor® Kit
若要检测、定量生物药中所含的DNA总量，必须先将其所含的DNA从蛋白质等其他活性成分中分离、纯化出来。传统上分离DNA时通常会采用蛋白酶消化样品，然后利用苯酚、氯仿将DNA提取出来的方法。然而，这种方法却有着这些缺点：在获得相对高纯度的DNA的同时，需要使用苯酚、氯仿等有害物质；并且需要花费工夫和时间进行提取操作。而使用二氧化硅等物质作为载体的固相提取方法会因为DNA被吸附到载体上而导致其损耗，因此并不适合用于回收痕量DNA。同样的，使用有机溶剂的方法的痕量DNA回收率也很低，这也是DNA提取试剂的问题之一。
本公司1992年起推出的DNA Extractor® Kit（中国药典版本产品编号：292-81101），通过使用碘化钠法解决了以上问题，只需简易的操作，便可以高回收率提取高纯度的DNA。
◆DNA Extractor® Kit的原理
本试剂盒※ 中包含碘化钠和表面活性剂，碘化钠作为蛋白质增溶剂（离液离子），与表面活性剂一同将样品中以蛋白质为主的成分转变为可溶状态，然后通过加入异丙醇，能够选择性地令核酸（主要是DNA）和糖原产生沉淀（即共沉淀）[2]。如上所述，该试剂盒实现了在不使用固相载体或有机溶剂的情况下，通过简化的提纯步骤获得了沉淀物，以高回收率提取痕量DNA。
※ 本试剂盒组分：碘化钠溶液、N-月桂酰肌氨酸钠溶液、洗净液（A）、洗净液（B）、糖原溶液
◆使用DNA Extractor® Kit提取DNA与定量DNA总量案例
笔者将在下文中重新介绍一次曾刊载于本公司和光纯药时报Vol.60 No.3 p.28（1992）中的案例，该案例报道了关于本试剂盒在存在赋形剂以及添加剂的情况下的DNA加标回收率。在该实验中，分别将通常用作赋形剂或添加剂的物质（精氨酸、尿素等）和蛋白质（BSA（牛血清白蛋白）和人γ球蛋白）以常量或过量溶解于磷酸盐缓冲液中，然后添加pg级的小牛胸腺DNA从而得到模型溶液。接下来，按照DNA Extractor® Kit的实验步骤，对400 µL的每种模型溶液进行DNA提取处理。将所得沉淀物溶解于500 μL的磷酸盐缓冲液中进行阈值法总DNA定量※[3][4]，测定其DNA的加标回收率。测定结果如表1所示。
|
赋形剂及其含量 |
DNA添加量（pg） |
DNA回收率（%） |
|
|
山梨糖醇 |
200 mg/mL |
50 |
95 |
|
50 mg/mL |
50 |
94 |
|
|
麦芽糖 |
400 mg/mL |
50 |
89 |
|
200 mg/mL |
50 |
102 |
|
|
50 mg/mL |
50 |
98 |
|
|
甘露醇 |
200 mg/mL |
50 |
84 |
|
葡萄糖 |
200 mg/mL |
50 |
81 |
|
蔗糖 |
200 mg/mL |
50 |
92 |
|
尿素 |
1 mol/L |
50 |
106 |
|
精氨酸 |
200 mg/mL |
50 |
110 |
|
γ球蛋白 |
60 mg/mL |
10 |
102 |
|
60 mg/mL |
5 |
84 |
|
|
60 mg/mL |
2.5 |
88 |
|
|
BSA |
200 mg/mL |
10 |
95 |
表1. 在存在赋形剂以及添加剂的情况下的DNA加标回收率
我们对5种糖类的不同浓度下的DNA回收率进行了测定，所有DNA加标回收率都在80%~110%范围内。另外，在精氨酸和尿素中也能够以高回收率提取DNA。在蛋白质方面，我们测定了BSA（牛血清白蛋白）和人γ球蛋白，发现两者的DNA回收率都很高。根据样品不同（如蛋白质种类），可能会发生蛋白质沉淀的情况，这种情况下只需稀释或使用蛋白酶处理即可[5]。从以上结果来看，本试剂盒可对广泛样品以高重复性和高回收率提取残留DNA。
※“阈值法总DNA定量”是指利用Molecular Devices公司的“Threshold® Total DNA assay system”进行的DNA总量定量的
※ 测定方法，是一种不依赖于序列的DNA定量测定方法。
该方法的总DNA检测灵敏度为2 pg/assay。
◆使用DNA Extractor® Kit提取痕量残留DNA与通过qPCR法进行定量的案例
如上所述，“Threshold® Total DNA assay system”是一种总DNA定量法，并不针对特定序列进行检测。如果希望检测出宿主细胞来源的残留DNA，可以利用qPCR法将特定序列作为检测对象。相对于阈值法的DNA定量，qPCR法有着能更高灵敏度检测残留DNA的这一优点，接下来我们将围绕其能否提取假定宿主细胞来源的痕量DNA进行探讨。
在本实验案例中，我们将常用于蛋白和抗体生产的CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞系细胞）以及大肠杆菌的基因组DNA作为残留DNA模型，通过提取痕量残留DNA以及以qPCR对其进行定量。实验步骤如图1所示。
图1. 实验步骤
首先，在100 μL的水（注射用蒸馏水）中添加了0.1 pg～100 pg各基因组DNA的样品，使用本公司的DNA提取试剂盒对上述样品提取DNA，然后将提取的DNA溶解于100 μL的水中。之后采用qPCR，并根据同时值得的校准曲线计算出添加DNA的回收量。结果，大肠杆菌基因组和CHO细胞基因组在0.1 pg～100 pg之间的加标回收率为85～120%（虽未在文中展示数据，但两种基因组在1000 pg以内回收率几乎为100%）。
接下来，进行模拟细胞培养上清液中含有残留DNA的实验。细胞培养上清液样品通过将0.1 pg CHO细胞基因组DNA添加到500 μL在10％FBS DMEM中培养3天的人胰腺癌细胞系Panc-1的培养上清液中配制而成。结果，根据生成的校准曲线所得的回收量为0.093 pg。通过上述实验证明，使用本试剂盒，即使是500 μL中所含残留DNA仅为0.1 pg（100 fg）的fg级别的痕量DNA也以高回收率进行提取。另外，由于DNA Extractor® Kit可以以90%以上的高回收率回收存在于水、磷酸盐缓冲液或是细胞培养上清液等样品中的痕量残留DNA（表1表2），因此可以证明本试剂盒的高回收率在不同样品中具有广泛性。
|
样品 |
DNA量 |
根据标准曲线所得回收DNA量（pg） |
加标回收率（%） |
|
注射用蒸馏水 |
0.1 pg |
ND（低于检测下限） |
－ |
|
1 pg |
1.031 |
103 |
|
|
10 pg |
11.09 |
111 |
|
|
100 pg |
85.1 |
85 |
|
|
注射用蒸馏水 |
0.1 pg |
0.933 |
93 |
|
0.1 pg |
1.187 |
119 |
|
|
10 pg |
11.57 |
116 |
|
|
100 pg |
87.1 |
87 |
|
|
人类细胞培养上清液 |
0.1 pg |
0.0928 |
93 |
表2. 基因组DNA加标回收率
◆结语
使用DNA Extractor® Kit，能够以高回收率回收样品中所含残留DNA。在定量残留DNA时，从样品中提取DNA是十分重要的一个步骤，即便是痕量残留DNA也可以通过本试剂盒进行高回收率提取。另外，由于本试剂盒能够用于广泛的样品，因此我们认为它不仅能用于CHO细胞，还能用于大肠杆菌和酵母等其他宿主细胞来源的残留DNA，有望在生物制药的质控中发挥作用。
◆参考文献
1. Knezevic et al. : Biologicals, 36:203-211(2008).
2. Ishizawa, M et al. : Nucleic Acids Res., 19, 5792(1991).
3. Kung. V. T et al. : Anal. Biochem., 187, 220-227(1990).
4. 水沢左衛子, 本間玲子. : Pharm Tech. Japan, 7, 309-314, 426-431(1991).
5. 和光純薬時報 Vol.61 No.1 p.27(1993)
◆产品列表
|
产品编号 |
产品名称 |
规格 |
|
292-81101 |
DNA Extractor™ Kit for Residual DNA, CP Method |
50 tests |
更多产品详情请点击：生物制药残留DNA提取试剂盒（碘化钠法） DNA Extractor® Kit
更多产品信息请点击下载产品宣传页：生物制药残留DNA提取试剂盒DNA Extractor® Kit
mtDNA Extractor® CT Kit
提取组织 · 细胞 · 复合饲料中的线粒体DNA
mtDNA Extractor® CT Kit
提取组织 · 细胞 · 复合饲料中的线粒体DNA
本产品是可在短时间内提取哺乳动物组织以及细胞内的线粒体DNA（mtDNA）的试剂盒。此外，还可用于从复合饲料中提取mtDNA。
◆特点
l 只需少量组织样品（5 mg），即可提取适用于 PCR 反应的 mtDNA。
l 从 50 mg组织（ 250 mg 骨骼肌） 中提取的mtDNA可通过琼脂糖凝胶电泳确认。
l 所提取的mtDNA纯度高，后续可用于PCR和限制性内切酶酶切分析。
l 可从冷冻组织中提取mtDNA。
l 无需添加如苯酚、氯仿等有机溶剂。
◆原理
1. 通过离心从细胞裂解液中获得线粒体断片。
2. 为除去线粒体断片中的基因组DNA，本试剂盒采用质粒DNA纯化中的碱-SDS方法，通过使基因组DNA碱发生变性并沉淀析出后，回收mtDNA（环状DNA）。
3. 使用碘化钠令混入的蛋白质等变为可溶性物质，再通过洗涤缓冲液纯化mtDNA。
◆试剂盒组成
1. Buffer for Homogenate（匀浆缓冲液）
2. DNA Extraction Solution 1
3. DNA Extraction Solution 2(A)
4. DNA Extraction Solution 2(B)
5. DNA Extraction Solution 3
6. 碘化钠溶液
7. 洗涤液
◆实验流程
◆实验示例
从小鼠的新鲜组织以及冷冻组织中提取mtDNA
从小鼠的新鲜组织中提取的mtDNA，取其中一半用Pst l处理，通过琼脂糖凝胶电泳进行确认。
从小鼠的冷冻组织中提取的mtDNA，取其中一半用Pst l处理，通过琼脂糖凝胶电泳进行确认。
◆使用过程中的注意事项
由于使用本试剂盒提取的mtDNA量较少，因此需要通过GelRed™染色才能在凝胶上被检测出来。本试剂盒无法用于溴化乙锭染色检测。
※ 本页面产品仅供研究用，研究以外不可使用。
| 产品编号 | 产品名称 | 产品规格 | 产品等级 | 备注 |
| 291-55301 | mtDNA Extractor CT Kit DNA提取试剂盒（从哺乳动物线粒体中提取） |
25 tests | 组织型mtDNA提取用 |
血清•血浆（Serum•Plasma）microRNA提取试剂盒
microRNA Extractor(R) SP Kit
血清·血浆（Serum·Plasma）microRNA提取试剂盒
microRNA Extractor(R) SP Kit
|
本产品主要用于提取人（或者实验动物：小鼠等）血清、血浆中microRNA。不使用苯酚和氯仿等有害物质，蛋白酶和离液剂、离心柱组合使用可简便且高效率获得血清·血浆中microRNA。适用于提取血液循环microRNA，各种疾病研究、检测活体转染实验中血液siRNA残留量样本的制备。 |
|
◆试剂盒组成（50次/试剂盒）
(1) Lysis Solution 19 mL×1 bottle
(2) Reducing Agent 50 μL×1 vial
(3) Protease Solution 500 μL×1 vial
(4) Enhancer 500 μL×1 vial
(5) Wash SolutionⅠ 12 mL×1 bottle
(6) Wash SolutionⅡ 21 mL×1 bottle
(7) Elution Solution 5 mL×1 bottle
(8) Spin Column 50 columns
(9) Collection Tube 50 tubes
需要以下试剂
1-Butanol（Code No.022-16035）
2-Propanol（Code No.168-21675）
Ethanol（Code No.054-07225）
<用前注意事项>
血浆的抗凝剂请使用EDTA或者柠檬酸。如果使用肝素的话，会影响RNA提取后的PCR检测。
◆实验流程
详细实验流程请看相关资料的说明书
正常人血浆microRNA提取·定量结果
内源性has-miR-16定量结果 内源性has-miR-451定量结果
本产品比以往方法有更高的提取效率（试剂盒·试剂的比较对象）
A公司试剂盒：有机溶剂与硅胶膜柱组合产品
B公司试剂盒：有机溶剂与硅胶膜柱组合产品
C公司试剂：AGPC法产品。
正常人血浆·血清microRNA提取·定量结果
内源性has-miR-16 定量结果
本产品的血浆、血清提取率比其他产品高
左图：正常人血浆（抗凝剂：EDTA）右图：正常人血清
定量检测：TaqMan® MicroRNA Assays（Life Technologies公司）
上图显示在血浆·血清提取效率方面，本试剂盒比A公司产品更高。另外，血浆比血清含有更多microRNA。
大鼠血浆·血清microRNA提取·定量结果
|
内源性rno-miR-16 提取▪定量结果
|
● 提取对象：实验动物亦可 ● 血浆的抗凝剂：EDTA。 ● 定量检测：TaqMan® MicroRNA Assays（Life Technologies公 司）。 ● 已确认在实验动物（大鼠）的血浆以及血清的提取效率方面，使用 本试剂盒比A公司试剂盒高。 |
回收效率的可重复性评估
|
正常人血浆滴加cel-miR-238定量回收结果
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● 确认可重复性高 ● 定量检测：TaqMan® MicroRNA Assays（Life Technologies公 司）。 ● 左图是添加104~108拷贝数的cel-miR-238至正常人血浆（抗凝剂：柠檬 酸钠）的回收率。 ● 在添加104拷贝数／test的低浓度下能够稳定地回收microRNA，回收 率在60%-80%。与基因组DNA和total RNA相比获取较困难的低分子 RNA也具有高回收率。 ● 注意：将Protocol记录的洗脱液添加量从50 μL提升到100 μL，回收率 增加5~20%。 |
相关资料
说明书
| 产品编号 | 产品名称 | 产品规格 | 产品等级 | 备注 |
| 295-71701 | microRNA Extractor(R) SP Kit 血清•血浆microRNA提取试剂盒 |
50次 | － | － |
| 291-70201 | microRNA Isolation Kit, Human/Mouse Ago1 microRNA纯化试剂盒，人/鼠Ago1 |
10次 | － | － |
| 292-66701 | microRNA Isolation Kit, Human Ago2 microRNA纯化试剂盒，人Ago2 |
10次 | － | － |
| 292-67301 | microRNA Isolation Kit, Mouse Ago2 microRNA纯化试剂盒，小鼠Ago2 |
10次 | － | － |
| 297-70301 | microRNA Isolation Kit, Human Ago3 microRNA纯化试剂盒，人Ago3 |
10次 | － | － |
产品型号10448030, 10448031
品 牌沃特曼
厂商性质代理商
溴化乙啶（EB）废液减量系统 Extractor™ EB减量回收系统是一套从凝胶染色液中快速去除EB的一步过滤装置。
Whatman 沃特曼 Extractor EB回收系统的一次性使用元件中含有活性炭基质，能够快速、方便的从电泳缓冲液中除去>99%的EB。每套装置可以处理10Lde凝胶染色液。过滤后的去污染的溶液可以安全的排放。
详情介绍
名称 : Whatman 沃特曼 Extractor EB回收系统
10448030, 10448031
Whatman 沃特曼 Extractor EB回收系统 10448030, 10448031
详细描述
, 10448030, 10448031
Whatman 溴化乙啶（EB）废液减量系统
Extractor? EB减量回收系统是一套从凝胶染色液中快速去除EB的一步过滤装置。
Extractor的一次性使用元件中含有活性炭基质，能够快速、方便的从电泳缓冲液中除去>99%的EB。每套装置可以处理10Lde凝胶染色液。过滤后的去污染的溶液可以安全的排放。
Extractor漏斗式设计可与大多数实验室标准烧瓶和玻璃瓶（瓶颈为33~45mm）配套使用，配备的盖子可方便不用时存放，聚丙烯材质容器抗化学有机物。装置还包括玻璃纤维预滤层，可用于除去凝胶颗粒和其他杂质，以过早避免堵塞活性炭滤层。
