致力于可溯源至SI的氨基酸检测
产业技术综合研究所 计量标准综合中心 加藤爱、山崎太一、井原俊英
1. 前言
氨基酸虽然是我们生活中常见的化合物，但由于其结构具有多样性，在分析上具有一定难度。目前已开发了多种氨基酸的分析方法，其中以色谱法为主流分析方法。色谱法的发展对于氨基酸分析的普及起到了重要作用。
近年来，氨基酸分析法不仅在常规的生化领域和食品领域广泛应用，在临床化学领域和医学领域中也得到了广泛应用，其检测结果的可靠性也逐渐备受关注。对于氨基酸分析仪中校准的关键——氨基酸标准溶液，日本产业技术综合研究所·计量标准综合中心（AIST/NMIJ）近十年以来，一直致力于提供可溯源至国际单位制（SI）的氨基酸混合标准溶液。
在FUJIFILM Wako推出可溯源至SI的氨基酸混合标准溶液之际，本文将围绕这一主题展开对NMIJ中的基础研究、标准物质的开发、以及混合标准液的技术转让的相关内容进行介绍。
2. 氨基酸认证标准物质（CRM）的开发
为确保氨基酸检测的计量溯源性，我们就17种蛋白水解氨基酸开发了具有高计量品质的氨基酸认证标准物质（Certified Reference Material; CRM）。对于CRM的形式，考虑到固体粉末有着优异的稳定性，以及用户可制备任何类型、浓度的溶液，可选择不同溶剂的优点，最终选择以固体粉末的形式进行供应。
对于氨基酸CRM纯度的定量，符合基准测量方法（Primary method）的方法有两种，一种是利用氨基酸碱性的非水滴定法，一种是滴定氨基酸所含氮的氮分析法。上述两种方法，滴定用试剂的高氯酸/乙酸溶液和硫酸的当量，分别通过邻苯二甲酸氢钾标准物质（NMIJ CRM 3001-a）和碳酸钠标准物质（NMIJ CRM 3005- )进行标定，以确保计量结果可溯源至SI1） 。
使用非水滴定法和氮分析法定量氨基酸时，需知道盐以及氮的纯度，但这两种方法都存在同时检测到其他相关杂质（主成分以外的胺）的可能性。实际上，部分候选标准物质中都含有不可忽略的相关杂质。
因此，利用滴定法确定氨基酸的纯度时，需准确定量相关杂质。通过结合柱后衍生化检测法（OPA法等）、柱前衍生化检测法（AQC法）、LC/MS等多种分离分析方法，可以准确定量相关杂质并构建评估系统2)，并将这些定量结果结合到滴定值上，求出氨基酸纯度。
我们对非水滴定法和氮分析法所得出氨基酸的纯度进行加权平均后，对17种氨基酸的纯度进行定量，最终CRM的扩展不确定度小于0.3%，纯度大于99.7%。另外，为满足氨基酸的光学异构体分析需求，还评估了CRM中甘氨酸以外的氨基酸的D型，并以“L型氨基酸的纯度“和”不考虑光学异构体时的纯度“两个作为认证值。
以此方式进行纯度评估的17种氨基酸CRM可在NMIJ网站上查询，并通过“相关从业人员”获取。CRM 随附的证书记录了认证值、认证值的确定方法、计量溯源性以及认证时的氨基酸相关杂质含量和D型氨基酸含量作为参考信息。
3. 氨基酸可溯源标准物质（TRM）的开发
对于蛋白氨基酸等（包含尿素以及氯化铵），产业技术综合研究所也在不断地完善认证标准物质（NMIJ CRM）。但是关于非蛋白氨基酸，从资源的角度考虑，由于早期开发比较困难，一直都没有完善的NMIJ CRM。因为其主要以混合标准溶液的形式提供，因此试剂厂家并没有开发以最高计量品质为目标的NMIJ CRM，而是通过“委托测试”的方式进行，即委托第三方评估预先分装并装瓶的原材料的纯度，并发布校准证书。
此外，对于两年开发22种氨基酸标准品的申请，在保证计量溯源性的同时还要重视速度，所以我们选择了与蛋白氨基酸略有差异的定量方式。除选择需要时间优化检测条件的滴定法，还结合了定量核磁共振光谱（qNMR）的纯度评估，兼顾计量溯源性以及检测效率。使用qNMR 应用于22种非蛋白氨基酸时，纯度的不确定度为0.5~1.9%（置信水平95%）。虽然精确度不及滴定法，但与从滴定法中获得的纯度和不确定度的范围有着良好的一致性3）。
与蛋白氨基酸类似，非蛋白氨基酸中杂质的定量通过结合LC/MS和柱后衍生液相色谱和滴定法，先定性、定量出杂质含量为0.01%以上的氨基酸，并减去滴定法获得的检测值来得出纯度。
准确稳定称量原材料对于分装并装瓶原材料、评估纯度，以及正确制备混合标准溶液来说有着重要意义。然而，非蛋白氨基酸几乎没有关于湿度环境和吸湿率相关的定量数据。当我们使用温度与湿度可控的热式重量计量设备进行评估时，在7种非蛋白质氨基酸中观察到明显的吸湿性，因此规定了操作时的湿度上限4）。
以上述方式进行纯度评估的22种非蛋白质氨基酸，根据其均一性和稳定性的评估结果，FUJIFILM Wako将其作为有保证的计量可溯源标准物质TRM（Traceable Reference Material）进行供应。
4. 确保国际比对时的国际一致性
NMIJ与世界各地计量机构的检测能力的等效性，通过BIPM（国际计量局）的CCQM（物质量咨询委员会）进行评估，并与国际间的计量机构的检测能力进行国际比对，并被国际互认。CCQM对纯度检测、浓度检测、成分分析等多个项目进行国际比对，获得的比较测试结果录入BIPM数据库中，可供查看5）。
关于氨基酸相关的纯度检测以及混合标准溶液的制备和检测能力，还进行了L-缬氨酸的纯度检测（CCQM-K55.c）和氨基酸混合标准溶液的浓度检测（CCQM-K148.b）相关的比对测试。NMIJ也参加了这方面的国际比对，在各参加测试的机构中取得优异的结果。
5. 精确制备混合标准溶液的系统构建及稳定性相关的基础研究
为提供具有计量可溯源性的氨基酸混合标准溶液，并考虑到标准溶液的稳定性，我们决定从开发的41种高纯度标准物质NMIJ CRM （19种）和TRM（22种）中，以L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-色氨酸和2-氨基己二酸外的37种氨基酸为对象构建精确混合标准溶制备系统。
由于人体含有氨基酸，所以在实验操作过程中比较容易造成污染。此外，还要注意制备混合标准溶液时，同时处理多种氨基酸时引起的相互污染。从防止吸湿的角度考虑，还需规定天平称量时的湿度上限。为使以上操作可以快速且稳定地进行并且无需依赖于制备人员的熟练度，我们于恒温恒湿实验室安装了配备粉末自动分配装置的天平系统。
由于该系统可将氨基酸单独分装至分装筒内，可减少人为污染以及相互污染。另外，只需更换分装筒就可以自动连续称量任意量的氨基酸，操作十分简单。
即使是老手也要花费半天制备的氨基酸混合标准溶液，若使用该系统制备，则只需1~2个小时，且所有组分都在0.3%的相对标准偏差值以内。
作为氨基酸混合标准溶液认证标准物质开发的重点，我们还对混合标准溶液中各组分的稳定性进行了基础研究。在进行评估时，我们发现市售氨基酸混合标准溶液的热门产品中，均未充分显示氨基酸混合标准溶液中各个组分的稳定性。
因此，使用上述的制备系统，在与热门产品相同的制备条件下（使用0.1 N稀盐酸溶解各氨基酸浓度至2.5 mM）制备氨基酸（17种）混合标准溶液，进行加速测试。结果显示，随着存储温度升高，谷氨酸环化并转化为焦谷氨酸。基于加速测试的结果预测谷氨酸的分解速度，推测冷藏储存时，谷氨酸的浓度含量在1年内最多会下降2%。
而使用较稀的盐酸制备混合标准溶液时，谷氨酸的稳定性得到改善，并且不会影响谷氨酸以外的水解氨基酸的稳定性。因此，优化谷氨酸pKa附近的溶剂pH对于确保谷氨酸的稳定性非常重要。除谷氨酸以外，在侧链也有羧基的2-氨基己二酸也会发生环化反应，所以，优化溶剂的pH对稳定这类结构的氨基酸也很重要6）。
6. 混合标准溶液制备技术的转让
基于上述的研究结果，产业技术综合研究所按照FUJIFILM Wako的研究委托，优化了氨基酸混合标准溶液的氨基酸浓度和溶剂的pH后，评估了各组分的稳定性，最终优化了5个剂型的氨基酸混合标准溶液，并建立了混合标准溶液的制备方法以及氨基酸浓度的评估方法。
最终，产业技术综合研究所将确立的制备方法技术转让予FUJIFILM Wako，通过两方机构进行共同测试，确认了氨基酸混合标准溶液生产现场的制备能力。2019年10月，FUJIFILM Wako取得了氨基酸混合标准溶液生产能力相关的ISO 17304的第三方认证。
7. 结语
为满足确保计量可溯源氨基酸的供应需求，我们开发了共41种高纯度标准物质NMIJ CRM和TRM。对于其混合标准溶液，也确立了精准的混合标准溶液制备方法以及评估方法。并对标准溶液组分稳定性进行了相关的基础研究，改善存在稳定性问题的组分的长期稳定性。
以这种方式开发的氨基酸混合标准溶液，确保了计量溯源性，并由FUJIFILM Wako进行供应。通过开发新型的高计量学品质和多种类的氨基酸混合标准溶液，为可溯源至SI的氨基酸检测奠定了基础。
8. 致谢
本研究的一部分基于FUJIFILM Wako委托产业技术综合研究所的研究而得以进行。感谢味之素株式会社，FUJIFILM Wako和产业技术综合研究所的各位研究人员，以及共同参与本研究的各位研究人员，感谢各位你们对本研究的指导和协助。在此，献上我们衷心的感谢。
◆参考文献
1. Kato, M. et al. : Anal. Sci., 31, 805 (2015).
2. Kato, M. et al. : Accred. Qual. Assur., 18, 481 (2013).
3. Saito, N. et al. : Bunseki Kagaku, 63 (11), 909 (2014).
4. Kato, H. et al. : Bunseki Kagaku, 66 (5), 375 (2017).
5. https://kcdb.bipm.org/AppendixB/KCDB_ApB_search.asp
6. Kato, M. et al. : Anal. Sci., 33, 1241 (2017).
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