抗 CD40（小鼠），单克隆抗体（FGK45）

发表于2024年4月9日由Whatman官网

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抗 CD40（小鼠），单克隆抗体（FGK45）

　　CD40 属于 TNF 受体超家族，并且介导广泛的免疫和炎症反应，包括T细胞依赖性免疫球蛋白类别转换，记忆B细胞发育和生发中心形成。 CD40-CD40L 的相互作用对 β-淀粉样蛋白诱导的小胶质细胞活化是必需的，因此被认为是阿尔茨海默病发病机制中的早期表现。CD40 由抗原呈递细胞组成型表达，包括树突细胞、B 细胞和巨噬细胞。与其在正常细胞上的广泛表达一致，CD40 也广泛在肿瘤细胞上表达，包括非霍奇金和霍奇金淋巴瘤，骨髓瘤和一些癌症，如鼻咽癌、膀胱癌、子宫颈癌、肾癌和卵巢癌。

◆产品描述

别名：肿瘤坏死因子受体超家族成员５； CD40L 受体

产品类型：单克隆抗体

◆特性

克隆号：FGK45

亚型：大鼠 IgG 2a

来源/宿主：从浓缩的杂交瘤组织培养上清液中纯化。

免疫原/抗原：重组小鼠 CD40 融合蛋白。

应用：流式细胞仪

功能性应用：激活体内和体外 B 细胞和 NK 细胞。对于体内研究，使用不含防腐剂的抗体（产品编号 AG-20B-0036PF）。

交叉反应性：小鼠

特异性：识别小鼠 CD40。

纯度：≥95％（SDS-PAGE）

纯度方法：蛋白G亲和纯化。

内毒素含量：<0.01 EU/μg 纯化蛋白（LAL测试；Lonza）。

浓度：1 mg/mL

配方：液体。保存在含 0.02％叠氮化钠的 PBS 中。

其他产品数据：广泛用于 CD40 的刺激性单克隆抗体。间接激活自然杀伤性细胞（NK），产生显著的抗肿瘤和抗转移作用。有效增强对传染源的免疫应答，并有可能用在治疗慢性自身免疫性炎症的过程发挥潜在作用。

运输和保存

运输：干冰

短期储存： 4℃

长期储存：-20℃

处理建议：开封后，请分装保存在 -20℃。避免反复冻融。

使用/稳定性：收到产品后保存于 -20℃，有限期至少 1 年。

参考文献

[1]	The SCID but not the RAG-2 gene product is required for S mu-S epsilon heavy chain class switching: A. Rolink, et al.;Immunity 5, 319 (1996)
[2]	Characterization of immature B cells by a novel monoclonal antibody, by turnover and by mitogen reactivity: A.G. Rolink,et al.; Eur. J. Immunol. 28, 3738 (1998)
[3]	Anti-CD40 antibody induces antitumor and antimetastatic effects: the role of NK cells: J.G. Turner, et al.; J.Immunol. 166, 89 (2001)
[4]	Therapeutic activity of agonistic monoclonal antibodies against CD40 in a chronic autoimmune inflammatory process: C.Mauri, et al.; Nat. Med. 6, 673 (2000)
[5]	Ovarian insufficiency and early pregnancy loss induced by activation of the innate immune system: A. Erlebacher, et al.;J. Clin. Invest. 114, 39 (2004)
[6]	CD154 is a negative regulator of autoaggressive CD8+ T cells in type 1 diabetes: C.M. McGregor, et al.; PNAS 101, 9345(2004)
[7]	IRF-7 is the master regulator of type-I interferon-dependent immune responses: K. Honda, et al.; Nature 434, 772(2005)
[8]	In vivo and in vitro regulation of type I IFN synthesis by synergistic effects of CD40 and type II IFN: J.A. Greene, et al.; J. Immunol. 176, 5995 (2006)
[9]	IL-10- and IL-12-independent down-regulation of allergic sensitization by stimulation of CD40 signaling: P.W. Hellings, et al.; J. Immunol. 177, 5138 (2006)
[10]	Agonistic Anti-CD40 Antibody Profoundly Suppresses the Immune Response to Infection with Lymphocytic Choriomeningitis Virus:C. Bartholdy, et al.; J. Immunol. 178, 1662 (2007)
[11]	Excessive interferon-α signaling in autoimmunity alters glycosphingolipid processing in B cells: A. Hee-Meng Tan, et al.;J. Autoimmun. in press (2017)

产品列表

产品编号	产品名称	产品规格	产品等级	备注
AG-20B-0036-C100	anti-CD40 (mouse), mAb (FGK45) 抗小鼠CD40单克隆抗体（FGK45）	100 μg	–	–
AG-20B-0036-C500	anti-CD40 (mouse), mAb (FGK45) 抗小鼠CD40单克隆抗体（FGK45）	500 μg	–	–

小鼠生殖工程学技术——6体外受精

发表于2024年4月9日由Whatman官网

小鼠生殖工程学技术——6体外受精

小鼠生殖工程学技术——6体外受精回到小鼠生殖工程学技术指南目录

小鼠生殖工程学技术——6体外受精回到小鼠生殖工程冻存及培养试剂

◆材料

1. 生理盐水生理盐水（大塚制药日本药典大塚生注食）

2. PMSG（asuka制药注射血清促性腺激素动物用性腺激素1000单位/管）

3. hCG（asuka制药注射用胎盘促性腺激素，动物用性腺激素3000单位/管）

4. 1 mL注射器（泰尔茂株式会社SS-01T2613S）

5. FERTIUP^® 精子预孵培养基（Cosmo Bio Co., Ltd）

6. CARD MEDIUM^®（Cosmo Bio Co., Ltd）

7. mTHF（Cosmo Bio Co., Ltd）

8. 电动移液器（法国吉尔森电动单道移液器P-200　P-20）

9. 黄色枪头（BM医疗器 Cat.No.110-96R）

10. 受精用的枪头（Quality Scientific Plastics Pipet Tip Cat.No.114）

11. 流动石蜡（Nacalai Tesque Cat.No.26137-85）

12. 培养皿（Corning 35mm X 10mm　Cat.No.430588）

13. 解剖用大剪刀（夏目制造所反剪刀 Cat.No.B-2）

14. 解剖用小剪刀（夏目制造所小直剪刀Cat.No.B-12）

15. 解剖用大钳子（夏目制造所无钩尖细的镊子 Cat.No.A-5）

16. 解剖用小钳子（夏目制造所尖镊子 Cat.No.A-45）

17. noesu剪刀（森田制造所电话03-3811-9730 特别订制品）

小鼠生殖工程学技术——6体外受精

18. 解剖针（夏目制造所 Broach holderCat.No.E-14）

19. 滤纸

20. 微管

22. 倒置显微镜

23. CO₂培养箱

◆方法

过量排卵处理

1. 把激素（PMSG 和hCG）溶于37单位/mL的生理盐水中

1. * 激素溶液在4°C下，可保存2周

2. 成年雄性小鼠（8~12周龄）需腹腔注射2次，第一次注射PMSG0.2 mL（7.5単位）/只，48小时后，第二次注射hCG 0.2 mL（7.5单位）/只，然后进行过量排卵处理。（通常最好在下午5~6点期间注射激素）

滴液准备

1. 按以下步骤，制作滴液（a、b、c），并静置在二氧化碳培养箱里，令气流稳定。

小鼠生殖工程学技术——6体外受精

a 在解冻精子前30分钟，制作个精子孵育用的培养皿（100 μL FERTIUP^® 精子预孵培养基液滴），准备静置在培养箱里；

小鼠生殖工程学技术——6体外受精

b 取卵前10分钟，制作受精用培养皿（200 µLCARD MEDIUM滴液1个），静置在培养箱里体外受精时，根据所用精子的不同有不一样的调试方法，详情请参考产品说明书。

小鼠生殖工程学技术——6体外受精

C 制作清洗卵子用的培养皿（80 µLmHTF滴液4个），在培养箱里静置30中以上

小鼠生殖工程学技术——6体外受精

采集精子

用酒精消毒所有的解剖器具

1. 让1~2只成年雄性小鼠（3~6个月龄）安乐死，用大剪刀和大钳子取出附睾管、附睾及一部分脂肪，在滤纸上切除附睾尾及去除血液和脂肪；

2. 把切除的的附睾尾放入精子预孵用培养皿的流动石蜡中；

小鼠生殖工程学技术——6体外受精

3. 用小镊子固定附睾尾，用noesu剪刀切开尾部中央的附睾管；

4. 用解剖针在附睾尾轻压，从附睾管的切开位挤压出精子块；

5. 迅速用解剖针挑出精子块，然后放进FERTIUP^® 的精子预孵培养基的滴液里；

＊在精子预孵培养皿的滴液里，如精子黏在解剖针的尖端，可用另一根解剖针轻柔地把精子剥离；

6. 把精子注射入FERTIUP^® 精子预孵培养基里，放进CO₂培养箱里（37°C 5% 二氧化碳 95% 空气）培养60分钟。

小鼠生殖工程学技术——6体外受精

采集卵子

用酒精消毒所有的解剖器具

1. 让进行了过量排卵处理的雌性小鼠在注射了hCG的15~17个小时后安乐死，取出小鼠的子宫、输卵管、卵巢、及一部

1. 分脂肪，然后在滤纸上切除输卵管的尾部及去除血液和脂肪；

2. 把输卵管浸入受精用培养皿的流动石蜡中；

小鼠生殖工程学技术——6体外受精

3. 用镊子把输卵管固定到培养皿底部，用解剖针撕破输卵管壁的胀大部分，把流出的卵子放入CARD MEDIUM 的滴液中。

小鼠生殖工程学技术——6体外受精

取出的输卵管放置在室温下3分钟以上，卵子的受精能力及生殖能力就会显著下降，因此从雌性小鼠安乐死后到将输卵管取出，再把卵子放入受精用的CARD MEDIUM滴液这一过程要在极短时间内完成（30秒内）。

一个人实验的情况下，请不要一次性安乐死数只雌性小鼠，应该一只只进行，并迅速采集卵子。

一滴CARD MEDIUM里，请引入一只雌性小鼠（两颗）的卵子。

4. 采集卵子后，把受精用培养皿静置在CO₂培养箱里进行30~60分钟的培养。

受精

1. 用受精用枪头（Quality Scientific Plastics Pipet Tip Cat.No.114），吸取约6µL预孵的精子悬浊液，然后注射进含有卵子的受精用培养皿的CARD MEDIUM滴液里（进行受精）；

2. 将受精用培养皿放在CO₂培养箱里进行培养；

小鼠生殖工程学技术——6体外受精

3. 受精3小时后，用玻璃微管吸取形态正常卵子，注射到新的清洗卵子用培养皿的mHTF滴液里，按照（a→b→c）顺序进行洗涤；

＊清洗时，要非常注意在清洗卵子培养皿的滴液上不能混有CARD MEDIUM^®

＊清洗前，卵子的透明带表面附着许多精子，使用装有黄色枪头的电动移液器（20μL），在受精用的培养皿的CARD MEDIUM^®滴液里移液20~30次后，再清洗卵子。

小鼠生殖工程学技术——6体外受精

4. 受精6个小时后，仔细观察卵子，去取单性生殖卵（卵子细胞内只有1个原核），培养至次日。

小鼠生殖工程学技术——6体外受精

正常受精卵可见第二极体和雌雄原核（见左图），单性生殖卵里只有一个原核（见右图），未受精卵无法看到原核（见右图）

5. 次日（受精24~28小时后），次日，只把发育到2细胞期的胚胎移到清洗卵子用的培养皿内留下的滴液里，数完胚胎数后，就能将其用于移植或者冻存。

2细胞期胚胎直到囊胚期前都能在体外进行培养，在培养时要使用KSOM/AA。

小鼠生殖工程学技术——6体外受精

参考文献

【1】 Takeo T., Nakagata N. 2015 Superovulation Using the Combined Administration of Inhibin Antiserum

and Equine Chorionic Gonadotropin Increases the Number of Ovulated Oocytes in C57BL/6 Female Mice. PLoS One.

2015 May 29;10(5):e0128330. doi: 10.1371/journal.pone.0128330.

更新说明

更新 2015.06.01

本实验与使用PMS/hCG进行体外受精的相比，有以下两个不同点。

第一点是在受精用培养皿的CARD MEDIUM滴液中放进两颗未受精卵子；第二点是需要6µL受精用的精子悬浊液。

更新 2015.09.03

注射CARD过量排卵诱导剂的小鼠日龄从24~28日改成25~29日。

注射量由0.2mL改成0.1mL~0.2mL。

更新2015.11.18

把CARD过量排卵诱导剂改写成CARD HyperOva™

用C57BL/6J小鼠进行实验时，发现26~30日龄的小鼠实验效果良好，特此更改注射期。

小鼠生殖工程学技术——1精子的冻存

发表于2024年4月9日由Whatman官网

小鼠生殖工程学技术——1精子的冻存

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◆材料

1、12周以上的雄性小鼠
2、noesu剪刀（森田制造所电话03-3811-9730 特别订制品）

小鼠生殖工程学技术——1精子的冻存

3、FERTIUP^® 精子冻存液（Cosmo Bio Co., Ltd）
4、mHTF
5、培养皿（Corning 35mm X 10mm　Cat.No.430588）
6、黄色枪头（BM医疗器 Cat.No.110-96R）
7、填充精子用的吸管(My Science Cryo Bio System 0.25mL cotton-plugged Sperm StrawsReferences.010261 or My ScienceFrance Cassou type Straws (AAA201)　0.25mL Cat.No.005565）
8、配套吸管用的注射器
9、自动移液器（GILSON PIPETMAN P-10 P-100）
10、加热板（37℃）
11、封口包装机（富士MPULSE 专业包装机器Cat.No.P-200）
12、冻结精子用的吸管
13、Triangle Cassette
14、液氮储存器和干式液态氮筒
15、剪刀

◆步骤

制作冻存精子悬浮装置

1、3厘米厚的泡沫切成圆柱状，塞进50mL的注射器外筒内（泰尔茂Cat. No.SS-50ESz）。

2、用火加热50mL注射器前端，来封堵前端口。

3、用铁丝把注射器固定在50cm的玻璃棒上。

小鼠生殖工程学技术——1精子的冻存

※该装置也可从Cosmo Bio直接购买

准备吸管及制作配套吸管的注射器

1、在填充精子用的吸管中部贴上标签，剪下棉塞处。
2、把1mL注射器（泰尔茂Cat. No.SS-01T）、三方活塞（泰尔茂 Cat.No.TS-TR1K）、橡胶管・塑料管（DRUMMOND　Cat.No.2-040-000）以及硅帽组装成如下图
3、精子填充用的吸管的棉塞一侧插进注射器的硅帽里使用。

制作精子悬浊液

1、在培养皿上制作冻存滴液（FERTIUP^®精子冻液：60μL），用流动石蜡覆盖滴液；

2、往被覆盖的滴液里再注射进冻存液（FERTIUP^®精子冻液：60μL）,得到一个更大的滴液。

※制作后的培养放置在37℃的加热板上至使用时才拿出。

小鼠生殖工程学技术——1精子的冻存

3、让成年雄性小鼠安乐死，把收集的左右附睾尾放置过滤纸上，在实体显微镜下小心地取出血液和脂肪。

4、在培养皿上少量的FERTIUP^®精子冻存液的滴液里小心地清洗附睾尾。

5、FERTIUP®精子冻存液的滴液里放进2个附睾尾，用noesu剪刀在附睾尾处剪开5~6切痕。

※只有一个附睾尾时，只需60μL FERTIUP^®精子冻存液的滴液。

小鼠生殖工程学技术——1精子的冻存

6、培养皿在37℃加热板上静置3分钟，为了得到均匀的精子悬浊液，需每分钟搅拌一次。

精子悬浊液填充吸管

1、把填充精子悬浊液的吸管插进吸管配套用的注射器内，往吸管注入约100μL的mHTF。
※一根吸管只能注入10μL的精子悬浊液，如果把吸管就这样浸泡在液氮中，吸管就会浮起来，所以mHTF充当砝码，让吸管沉浸在液氮底部。

小鼠生殖工程学技术——1精子的冻存

2、注入mTHF后，吸管前端需留有15mm的空隙。
3、用黄色枪头吸取培养皿上10μL的精子悬浊液，然后注射进吸管里。

小鼠生殖工程学技术——1精子的冻存

4、接着再留15mm空隙，用封口机封住吸管端口。

小鼠生殖工程学技术——1精子的冻存

※拉开注射器内筒，观察精子悬浊液和mHTF的状态来确认是否已完全密封。如果精子悬浊液和mHTF移动了，就需再次封口。
5、从注射器内，移走吸管，用封口机把吸管的另一侧封住。
6、重复1~5个步骤，制作10~11根填充了精子悬浊液的吸管。

冻存（使用液氮储存）

1、吸管内精子悬浊液一侧朝下放进浮物里。
2、浮物浮在液氮面上，大概静置10分钟后，让浮物浸泡在液氮里。

小鼠生殖工程学技术——1精子的冻存

3、捞起装满了液氮的浮物，把吸管移至预先在液氮内冷却的Triangle cassette，存放在液氮里

小鼠生殖工程学技术——1精子的冻存

冻存（使用干式液态氮筒）

1、吸管内精子悬浊液一侧朝下，放进Triangle cassette内。
2、从干式液态氮筒里取出一个容器（金属制造的筒），然后把Triangle cassette翻入容器里，盖上干式液态氮筒的盖子。

※在使用干式液态氮筒的前一天，筒内装满液氮，让筒内的吸附剂充分吸收液氮，吸收不了的多余的液氮，使用前之前倒掉。

3、静置10分钟

※用干式液态氮筒冻存精子时，可以直接运输放进干式液态氮筒里的精子。

小鼠生殖工程学技术——1精子的冻存

小鼠生殖工程学技术——2精子复苏

发表于2024年4月9日由Whatman官网

小鼠生殖工程学技术——2精子复苏

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◆材料

1、过量排卵处理后的雌性小鼠
2、 FERTIUP^®精子预孵培养基（Cosmo Bio Co., Ltd）
3、 CARD MEDIUM^®（Cosmo Bio Co., Ltd）
4、 mHTF（Cosmo Bio Co., Ltd）
5、枪头（Pipette Tip Cat.No.114 Quality Scientific Plastics）
6、培养皿（Corning 35mm×10mm Cat.No.430588）
7、与吸管配用的注射器
8、恒温水箱（37°C）
9、精子复苏用的Float
10、自动移液器（GILSON PIPETMAN P-200 P-1000）
11、CO₂培养箱
12、剪刀
13、吸水纸

◆方法

制作复苏精子的漂浮装置

1、50mL的离心管与泡沫组合成漂浮装置如下图，用于精子复苏。

小鼠生殖工程学技术——2精子复苏

复苏精子前的准备

1、准备恒温水箱（37°C）
2、用37°C的温水装满装置里的离心管后，放进水箱里，漂浮装置就会浮起来，如下图

小鼠生殖工程学技术——2精子复苏

3、在复苏精子前30分钟，制作精子预孵培养皿（滴入90μL FERTIUP^®精子预孵培养基），准备静置在培养箱里。

小鼠生殖工程学技术——2精子复苏

4、收集卵子的前10分钟，制作受精用的培养皿（滴入一个90μL CARD MEDIUM^®滴液，静置在培养箱。

小鼠生殖工程学技术——2精子复苏

※根据体外受精用的精子的不同，CARD MEDIUM^®调试方法也不同。具体请参考操作说明书。

5、制作清洗卵子用的培养皿（80µL mHTF滴液4个），在培养箱里静置30分钟以上。

小鼠生殖工程学技术——2精子复苏

采集卵子

1、让进行了过量排卵处理的雌性小鼠在注射了hCG 的15~17个小时后安乐死，然后把卵子放进受精用的培养皿的CARD MEDIUM^®滴液里（一滴液里可放2~3只小鼠的卵子）

※ 从雌性小鼠安乐死后到将输卵管取出，再把卵子放入受精用的CARD MEDIUM^®滴液这一过程要在极短时间内完成（30秒内）

※一个人实验的情况下，请不要一次性安乐死数只雌性小鼠，应该一只只地进行，并迅速提取卵子。
2、采集卵子后，把受精用培养皿放进 CO₂培养箱里预孵培养30~60分钟。

小鼠生殖工程学技术——2精子复苏

精子的复苏

1、用钳子取出液氮储存器里的吸管，在空气中逗留5秒，立刻放置37°C恒温水箱的装置里，进行加热。

要点：为确保在37°C下加热，将吸管里的冻存精子朝下方放进浮动物里。

要点：冻融的精子会因处在的周围环境的变化而变弱，在精子运动前，从高粘性精子保存液里移至低粘性培养基（FERTIUP^®精子预孵培养基），复苏后的精子的运动能力不会完全恢复。为了能让复苏后的精子在37°C加热5分钟以上精子就能很好地运动，请让试管在37°C温水中静置10分钟后，将精子悬浊液移至预孵培养基中(FERTIUP^®精子预孵培养基)。
2、加热后，从37°C恒温水箱里取出试管，用吸水纸把试管表面的水分吸干。

取出精子悬浊液进行预孵

1、切断吸管内的mHTF与封口的中间处（要提前拉出注射器的内筒）

小鼠生殖工程学技术——2精子复苏

2、把剪断后的吸管插入到注射器里。

小鼠生殖工程学技术——2精子复苏

3、吸管插入注射器后，吸管内气压变高，为了释放气压，需要转动一次三路活塞的一个旋塞。

小鼠生殖工程学技术——2精子复苏

4、旋塞往上回正后，切断精子悬浊液与封口中间处。

小鼠生殖工程学技术——2精子复苏

5、慢慢按下注射器内筒，只把精子悬浊液注射进精子预孵培养皿的滴液中。

小鼠生殖工程学技术——2精子复苏

6、往培养箱内放入5个精子预孵培养皿，培养30分钟。

要点：精子预孵培养皿需要静置在培养箱里直到精子已完全复苏。请注意不要在精子完全复苏前摇动培养皿，否则精子的运动性能就不能完全得到恢复。

受精

1、用枪头（Pipette Tip Cat.No.114 Quality Scientific Plastics），吸取预孵后的精子悬浊液10μl，注射进含有卵子的受精培养皿的CARD MEDIUM^®滴液里。（受精）
2、受精后，把受精用的培养皿放进培养箱里进行3小时培养。

小鼠生殖工程学技术——2精子复苏

要点：受精用的精子悬浊液是从集合优良精子的预孵培养液滴液的边缘里收集。（请参阅下图

要点：一个滴液里可收集3~4次精子悬浊液。

要点：精子悬浊液要注射进受精用培养皿的滴液里，使卵子充分接触精子悬浊液。

小鼠生殖工程学技术——2精子复苏

3、受精后3小时，在清洗卵子用培养皿的滴液清洗正常形态的卵子，培养至次日。

※清洗前，由于卵子的透明带上会附着许多精子，所以用装上枪头的自动移液器，把受精用培养皿的CARD MEDIUM^®滴液移液20~30次后，才清洗卵子。

※清洗的时候，请注意，尽量不要把CARD MEDIUM^®带入到清洗卵子用培养皿的滴液里。

小鼠生殖工程学技术——2精子复苏

4、受精6个小时后，仔细观察卵子，摘取单性生殖卵（卵子细胞内只有1个原核），培养至次日。
5、次日，只把发育到2细胞期的胚胎移到清洗卵子用的培养皿内留下的滴液里，数完胚胎数后，就能将其用于移植或者冻存。

小鼠生殖工程学技术——2精子复苏

小鼠生殖工程学技术——4取出低温运输的小鼠附睾尾部

发表于2024年4月9日由Whatman官网

小鼠生殖工程学技术——4取出低温运输的小鼠附睾尾部

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◆材料

1、用CARD冷藏运输试剂盒运输的小鼠附睾尾
2、FERTIUP^®精子预孵培养基（Cosmo Bio Co., Ltd）
3、mHTF
4、电动移液器（GILSON PIPETMAN P-200）
5、黄色枪头（BM机器 Cat.No.110-96R）
6、流动石蜡（nacalai Cat.No.26137-85）
7、培养皿（Corning 35mm×10mm Cat.No.430588）
8、解剖用的剪刀（夏目制造所小直剪刀 Cat.No.B-12）
9、解剖用的钳子（夏目制造所尖钳子 Cat.No.A-45）
10、滤纸
11、CO₂ 培养箱

◆方法

1、取出附睾尾的前30分钟，制作精子预孵用培养皿（一个100μL FERTIUP^®精子预孵培养基滴液），静置在培养箱里。

小鼠生殖工程学技术——4取出低温运输的小鼠附睾尾部

2、从泡沫箱里取出保温瓶，再从保温瓶内的纸盒里取出装有附睾尾的0.2mL EP管。
3、打开0.2mL EP管的盖子，取出附睾尾放在滤纸上，擦干附睾尾表面的冻存液。

※用剪刀和钳子来除去附睾尾上留有多余的脂肪、组织、血液。

小鼠生殖工程学技术——4取出低温运输的小鼠附睾尾部

4、在清洗用培养皿的mHTF滴液内清洗3次附睾尾，用滤纸擦干附睾尾上mHTF。
※清洗用培养皿（3个大约100μL 的mHTF滴液），取出的附睾尾直接在此清洗。

小鼠生殖工程学技术——4取出低温运输的小鼠附睾尾部

5、把附睾尾浸泡在精子预孵用培养皿的流动石蜡里。

小鼠生殖工程学技术——4取出低温运输的小鼠附睾尾部

6、在附睾尾部采集精子，供体外受精用，采集的精子进行体外受精的步骤与用新鲜精子受精的步骤相同。

要点：在附睾尾的切口处采集精子时，如果精子难以露出，就往切口处再切深点，尽量采集更多的精子。

注意：用冷藏精子的受精培养基（CARD MEDIUM^®)的调试方法与用新鲜精子受精的方法有差异，请详细阅读受精培养基的使用说明，准备受精用培养皿。

小鼠生殖工程学技术——9CARD以外的方法冻存的精子进行体外受精

发表于2024年4月9日由Whatman官网

小鼠生殖工程学技术——9CARD以外的方法冻存的精子进行体外受精

小鼠生殖工程学技术——9CARD以外的方法冻存的精子进行体外受精回到小鼠生殖工程学技术指南目录

小鼠生殖工程学技术——9CARD以外的方法冻存的精子进行体外受精回到小鼠生殖工程冻存及培养试剂

◆材料

1、用CARD以外的方法来冻存精子（冻存管或者吸管）
2、过量排卵处理后的雌性小鼠
3、FERTIUP^®精子孵育培养基（Cosmo Bio Co., Ltd）
4、CARD MEDIUM^{^®}（Cosmo Bio Co., Ltd）
5、mHTF
6、恒温水箱（37°C）
7、复苏精子用的漂浮装置
8、剪刀
9、吸水纸
10、1.5 mL EP管（微型离心管）（Quality Scientific Plastics 1.5ml Graduated Microcentrifuge Tube with Flat Top Cap, Natural Cat.No. 509-GRD-Q）
11、离心分离机
12、电动移液器（GILSON PIPETMAN P-200 P-1000）
13、培养皿（Corning 35mm X 10mm Cat.No.430588）
14、流动石蜡（nacalai Cat.No.26137-85）
15、CO2培养箱

◆方法

制作复苏精子的漂浮装置

1、50ml的离心管与泡沫组合成漂浮装置如下图，用于精子复苏。