PROTEOSTAT® Aggresome detection kit
蛋白聚集小体检测试剂盒
- 产品特性
- 相关资料
- Q&A
- 参考文献
蛋白聚集小体检测试剂盒
PROTEOSTAT® Aggresome detection kit
◆原理
聚集小体（Aggresome）是由一群不正常堆叠在一起的蛋白质所形成的包涵体（Inclusion Bodies）。聚集小体的出现往往也表明细胞正处于某种应激状态，比如高温、病毒感染、活性氧自由基攻击等。聚集体通常是响应细胞应激而形成，并通过分离错误折叠的蛋白质提供细胞保护机制，最终导致它们被自噬清除。此外，蛋白质聚集体的形成是多种人类疾病的标志，例如阿尔茨海默氏症、帕金森氏症、肌萎缩侧索硬化症或酒精性肝病。
PROTEOSTAT® Aggresome detection kit中包含的 PROTEOSTAT® 是一种分子转子染料，在溶液中沿着单个中心键的自由分子内旋转可防止荧光产生。当它特异地插入到错误折叠和聚集的蛋白中的交叉β-sheet四级结构中，旋转受到抑制并导致发出强烈的荧光。
PROTEOSTAT® 聚集小体检测试剂盒提供了一种快速、特异、定量的方法来标记细胞中的聚集小体，且无需进行人工蛋白定点突变。PROTEOSTAT® 染料已在广泛的条件下对多种小分子调节剂进行验证，适用于具有治疗价值的化学物的筛选。此外，本试剂盒还适用于多重免疫荧光，以在自噬和聚集体形成的背景下研究您的目标分子。
◆试剂盒组成
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组分 |
包装 |
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PROTEOSTAT® Aggresome Detection Reagent |
10 μL |
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Hoechst 33342 Nuclear Stain |
50 μL |
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Proteasome Inhibitor (MG-132) |
120 nM |
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10×Assay Buffer |
25 mL |
◆特点
● 提供基于细胞的灵敏的药物反应性测定，以在真实的细胞环境中识别与神经退行性疾病相关的抑制剂
● 可靠且简单的检测，不需要非生理性蛋白质突变或基因工程细胞系
● 作用条件广泛，适用于筛选具有潜在治疗价值的小分子化合物
● 已进行优化以兼容免疫染色
● 可通过流式细胞术轻松量化聚集体和相关包涵体
● 可用于神经退行性疾病、肝病、毒理学研究等的研究
◆案例・应用
■ 应用实例 1：流式细胞术检测聚集小体
流式细胞术的分析：Jurkat细胞在37°C下用 0.2% DMSO对照或用5 µM MG-132诱导过夜。处理后，将细胞固定并与PROTEOSTAT® 染料一起孵育，无需洗涤即通过流式细胞术在FL3通道中使用488 nm激光进行分析。在 MG-132处理的细胞中，红色荧光信号增加约3倍。所描述的测定允许评估蛋白质聚集的影响。
使用PROTEOSTAT® 试剂预测并监控ADCs的聚集
使用PROTEOSTAT® 试剂预测并监控ADCs的聚集
就像特洛伊木马一样，抗体-药物偶联物（ADC）是经过精心设计的单克隆抗体，在不被注意到的情况下，将细胞毒性药物传递给表达抗原靶标的细胞。ADC的成功开发需要优化几个要素，包括抗体、细胞毒性药物的效力、接头的稳定性、结合位点和所得结合物的化学计量。
ADC开发的难度在于，必须要优化多种组合。ADC性能的主要影响因素是药物结合的效率。未结合的抗体以及与ADC相连的药物数量的变化会严重影响药物的功效、稳定性、靶标特异性和毒性。
生物制药公司Innate Pharma开发了用于治疗癌症和炎症性疾病的新型免疫疗法药物，并开发了一种新的ADC耦合技术。为了验证该技术在临床上的应用，通过测ADC产品的聚集倾向以及物理和化学稳定性来评估ADC产品的稳定性。使用PROTEOSTAT染料收集的数据与通过尺寸排阻高效液相色谱（SE-HPLC）和液相色谱-质谱（LC-MS）获得的结果一致。
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材料 |
类型 |
制造商 |
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SGN30 S-sp1a–Click–sp2-vcMMAE |
ADC产品 |
Innate Pharma |
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SGN30 Q-sp1a–Click–sp2-vcMMAE SGN30 S-sp1b–Click–sp2-vcMMAE SGN30 Q-sp1b–Click–sp2-vcMMAE |
ADC产品 |
Innate Pharma |
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ADC产品 |
Innate Pharma |
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ADC产品 |
Innate Pharma |
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ADC产品 |
Innate Pharma |
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ADC产品 |
Innate Pharma |
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ADCETRIS® |
参考控制 |
Seattle Genetics |
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稀释液 |
Innate Pharma |
表1：ADC产品和ADCETRIS®
PROTEOSTAT蛋白聚集测定与ADC产品一起使用，以测量和比较可溶/不溶和非共价聚集体的水平。PROTEOSTAT热位移稳定性测定用于确定ADC产品的聚集温度（Tagg）。低Tagg值与较大聚集倾向相关。PROTEOSTAT蛋白聚集测定结果与通过SE-HPLC和LC-MS获得的结果一致。
数据表明PROTEOSTAT染料有助于正确预测ADC产品的聚集倾向，并验证了Innate Pharma的新型ADC偶联技术适用于稳定ADC产品的开发。这将PROTEOSTAT染料定位为预测ADC产品在对抗癌症中的蛋白质聚集倾向的正交方法。
表2：Innate Pharma和ADCETRIS® 开发的ADC产品的聚集倾向。
箭头从绿色（较高Tagg）更改为红色（较低的Tagg）。 温度越低，聚集的倾向就越大，因此呈红色。
◆产品列表
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产品编号 |
产品名称 |
规格 |
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ENZ-51023-KP002 |
PROTEOSTAT Protein aggregation assay |
2×96 tests |
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ENZ-51023-KP050 |
PROTEOSTAT Protein aggregation assay |
50 tests |
PROTEOSTAT® 蛋白聚集小体检测试剂盒 样品实例
PROTEOSTAT® 蛋白聚集小体检测试剂盒 样品实例
细胞系
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物种 |
组织 |
细胞 |
细胞类型 |
名称 |
参考文献 |
|
人 |
血液 |
白血病细胞 Leukemia |
细胞系 Cell line |
Jurkat |
D.Shen, et al. (2011) |
|
人 |
血液 |
多发性骨髓瘤细胞 Multiplemyeloma |
细胞系 Cell line |
IM-9 |
S.Moriya, et al. (2013) |
|
人 |
血液 |
多发性骨髓瘤细胞 Multiple myeloma |
细胞系 Cell line |
RPMI 8226 |
S.Jagannathan, et al. (2015); M.A. Abdel Malek, et al.(2014); S. Moriya, et al. (2013) |
|
人 |
血液 |
多发性骨髓瘤细胞 Multiple myeloma |
细胞系 Cell line |
U266 |
M.A.Abdel Malek, et al. (2014); M.A. Hamouda, et al(2014); S.Moriya, et al. (2013) |
|
人 |
乳房 |
腺癌细胞 Adenocarcinoma |
细胞系 Cell line |
MCF-7 |
D.S.Nkandeu, et al. (2013) |
|
人 |
宫颈 |
腺癌细胞 Adenocarcinoma |
细胞系 Cell line |
HeLa |
L. Wunderley, et al. (2014); A. Kothawala, et al. (2012); I. Raju, et al. (2011); D. Shen, et al. (2011) |
|
人 |
结肠 |
癌细胞 Carcinoma |
细胞系 Cell line |
HCT-116 |
P.Magnaghi, et al. (2013) |
|
人 |
食道 |
癌细胞 Carcinoma |
细胞系 Cell line |
SNO |
E.Wolmarans, et al. (2014) |
|
人 |
肾 |
胚胎细胞 Embryonic |
细胞系 Cell line |
HEK293 |
Y.Kamada, et al. (2015); B. Jeric, et al. (2013); J. vanHengel,et al. (2012) |
|
人 |
肺 |
正常上皮细胞 Normal epithelial |
细胞系 Cell line |
BEAS-2B |
H.W.Chiu, et al. (2015) |
|
人 |
胰腺 |
癌细胞 Carcinoma |
细胞系 Cell line |
MIA PaCa-2 |
M.T.Pacheco, et al. (2014) |
|
人 |
前列腺 |
腺癌细胞 Adenocarcinoma |
细胞系 Cell line |
PC3 |
M.I.Koukourakis, et al. (2015) |
|
人 |
前列腺 |
癌细胞 Carcinoma |
细胞系 Cell line |
DU145 |
M.I.Koukourakis, et al. (2015) |
|
人 |
皮肤 |
黑色素瘤细胞 Melanoma |
细胞系 Cell line |
SK-MEL-28 |
M.T.Pacheco, et al. (2014) |
|
人 |
胃 |
腺癌细胞 Adenocarcinoma |
细胞系 Cell line |
AGS |
C.C.Yu, et al. (2013) |
|
小鼠 |
肝脏 |
肝细胞 Hepatocytes |
细胞系 Cell line |
Hepa-1c1c7 K |
K.Ohnishi, et al. (2013) |
|
小鼠 |
胰腺 |
胰岛瘤细胞（β细胞） Insulinoma (beta cells) |
细胞系 Cell line |
MIN6 |
A.Hofmeister-Brix, et al. (2013) |
|
小鼠 |
周围神经系统 |
施万细胞 Schwann cells |
细胞系 Cell line |
TgS1 |
T.Murakami, et al. (2015) |
|
小鼠 |
血液 |
白血病细胞 Leukemia |
细胞系 Cell line |
RAW 264.7 |
H.W.Chiu, et al. (2015) |
|
植物 |
烟草 |
培养细胞 Cultured cells |
细胞系 Cell line |
BY-2 |
Y.Nakajima, et al. (2013) |
|
大鼠 |
心脏 |
心肌细胞 Cardiomyoblasts |
细胞系 Cell line |
H9c2 |
J.W.Jahng, et al. (2015) |
|
非洲爪蟾 |
肾 |
上皮细胞（瓜蟾）Epithelial cells from X.laevis |
细胞系 Cell line |
A6 |
S.Khan, et al. (2014) |
原代细胞
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物种 |
组织 |
细胞 |
细胞类型 |
名称 |
参考文献 |
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人 |
冷藏精液 Cryopreserved semen |
原代细胞 Primary |
Y.J.Yi, et al. (2014) |
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|
人 |
大脑 |
iPSC神经元前体细胞 iPSCneuronal precursor cells |
原代细胞 Primary |
S.M.Usmani,etal. (2014); C.E. Kennedy, et al. (2014) |
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|
小鼠 |
大脑 |
星形胶质细胞 Astrocytes |
原代细胞 Primary |
M.Polajnar, et al. (2014) |
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|
小鼠 |
肠 |
腹膜巨噬细胞 Peritoneum-derived macrophages |
原代细胞 Primary |
Y.Nakajima, et al. (2013) |
|
|
小鼠 |
肝脏 |
肝细胞 Hepatocytes |
原代细胞 Primary |
Y.Yamada, et al. (2015); U. Tomaru, et al. (2012) |
|
|
小鼠 |
皮肤 |
成纤维细胞 Fibroblasts |
原代细胞 Primary |
A.Hofmeister-Brix, et al. (2013) |
|
|
植物 |
葡萄藤 |
培养细胞 Cultured cells |
原代细胞 Primary |
Y.Nakajima, et al. (2013) |
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|
植物 |
烟草 |
培养细胞 Cultured cells |
原代细胞 Primary |
A.Flierl, et al. (2014) |
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|
猪 |
卵母细胞 Oocytes |
原代细胞 Primary |
T.Mocan, et al. (2015) |
其他样品
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物种 |
组织 |
细胞 |
细胞类型 |
名称 |
参考文献 |
|
人 |
大脑 |
神经元（长期分化神经上皮干细胞）Neurons (differentiated long-term neuroepithelial stem cells) |
J.Mertens, et al. (2013) |
||
|
人 |
肺 |
组织切片 Tissue section |
A.S.Patel, et al. (2012) |
||
|
小鼠 |
心脏 |
组织切片 Tissue section |
Y.Maejima, et al. (2013) |
||
|
大鼠 |
肾 |
匀浆 Homogenates |
M.U.Cheema, et al. (2013) |
相关产品请点击：ProteoStat 蛋白聚集小体检测试剂盒
Enzo独有的PROTEOSTAT® 染料
Enzo独有的PROTEOSTAT® 染料
Enzo PROTEOSTAT® 系列依赖于独有的分子转子染料技术，可与聚集的蛋白结合，发出比其他染料更亮的荧光，并准确检测蛋白聚集。
↑ Enzo的染料比其他染料更亮，提供了更清晰的结果和更有效的分析数据。
◆产品亮点
PROTEOSTAT® 蛋白聚集分析试剂盒
PROTEOSTAT® Protein Aggregation Assay
在开发、配制、生产、运输和储存的过程中，当蛋白暴露于不同的环境（包括pH，温度、光照、氧气、机械应力和冻融循环）时，大量的蛋白会发生聚集。
↑ 使用PROTEOSTAT® 检测试剂与硫磺素T，在抗体聚集检测中的有效线性动态范围。
◆特点
● 简单，灵敏，同质
● 可与微孔板一起用于流式细胞仪平台
● 广泛使用IgG进行基准测试
● 优化了缓冲液和辅料
● 具有广泛的pH和离子强度范围
● 与PROTEOSTAT® 蛋白聚集标准品（PROTEOSTAT® Protein Aggregation Standards）一起使用，可精确定量
● 溶液中的聚集蛋白。
◆产品列表
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产品编号 |
产品名称 |
包装 |
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ENZ-51023-KP002 |
PROTEOSTAT® Protein Aggregation Assay |
2×96 tests |
PROTEOSTAT® PDI assay kit 蛋白二硫键异构酶检测试剂盒
PROTEOSTAT® PDI assay kit
蛋白二硫键异构酶检测试剂盒
- 产品特性
- 相关资料
- Q&A
- 参考文献
PROTEOSTAT® PDI assay kit
蛋白二硫键异构酶检测试剂盒
PROTEOSTAT® PDI 检测试剂盒能够以稳定且高通量的方式定量检测PDI酶活性，适用于从化学库中筛选PDI抑制剂，为筛选PDI酶活性调节剂提供了一种简单、均相的检测方法。
本试剂盒在二硫苏糖醇（DTT）存在的条件下，PDI酶催化胰岛素聚集体的形成，随后与发射红色荧光的 PROTEOSTAT® PDI检测染料结合，通过监测胰岛素减少来实现对PDI酶活性的检测。
相对于使用比浊法检测PDI酶活性，基于荧光的检测法有着极大改进的信号检测窗口和检测下限，以及优越的 Z' 因子（>0.8）。检测中板内和板间CV值为3-5%。
本试剂盒中包含人重组PDI酶（EC 5.3.4.1）、杆菌肽（PDI抑制剂）以及监测PDI酶活性变化所需的全部试剂。
◆产品详情
基础信息
别称：蛋白二硫键异构酶（Protein disulfide isomerase）检测试剂盒
应用：荧光检测
储存条件：避光。避免反复冻融。
运输方式：干冰运输
长期储存温度：–80°C
特点：本试剂盒为筛选蛋白二硫键异构酶（PDI）酶活性的调节剂提供了一种简单、均相的检测方法。
UniProt ID：P07237（人）
监管状态：RUO – 仅供研究使用
技术信息/产品说明：Enzo和PROTEOSTAT®是Enzo Life Sciences, Inc. 的商标。
技术信息/产品说明：Enzo的部分产品和产品应用受美国、外国专利及正在申请的专利保护。
品质保证
（1）按照手册中的步骤， PROTEOSTAT® PDI检测试剂盒可用于检测以下样品：
（1）① 含PDI的胰岛素；② 不含PDI的胰岛素；③ 含有PDI和杆菌肽的胰岛素。
（2）Z' 因子高于0.8。
（3）PDI活性至少可被杆菌肽抑制50%。
使用/稳定性
在产品标签注明的日期前，试剂盒组分在适当的储存条件下可稳定保存。
可存放于-20°C的无霜冰箱中，或在–80°C下长期保存。
组分
● PROTEOSTAT® PDI 检测试剂
● PDI（人）（重组）
● 胰岛素（冻干）
● 杆菌肽（抑制剂对照，冻干）
● PBE 缓冲液
● 终止试剂
● DTT（10 mM）
● 去离子水
※ 本页面产品仅供研究用，研究以外不可使用。
参考文献
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1. |
Thioredoxin reductase is a major regulator of metabolism in leukemia cells: S. Karunanithi, et al.; Oncogene 41388 (2021), Abstract; |
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2. |
Molecular docking‐assisted screening reveals tannic acid as a natural protein disulphide isomerase inhibitor with antiplatelet and antithrombotic activities: L. Ren, et al.; J. Cell. Mol. Med. 24, 14257 (2020), Abstract; Full Text |
|
3. |
PDI knockdown inhibits seizure activity in acute seizure and chronic epilepsy rat models via S-nitrosylation-independent thiolation on NMDA receptor: A.R. Jeon, et al.; Front. Cell. Neurosci. 12, 438 (2018), Application(s): Hippocampal tissue lysates, Abstract; Full Text |
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4. |
The thiosemicarbazone Me2NNMe2 induces paraptosis by disrupting the ER thiol redox homeostasis based on protein disulfide isomerase inhibition: S. Hager, et al.; Cell Death Dis. 9, 1052 (2018), Abstract; Full Text |
|
5. |
Tissue Factor Coagulant Activity is Regulated by the Plasma Membrane Microenvironment: Y. Yu, et al.; Thromb. Haemost. 118, 990 (2018), Application(s): In-vitro activity assay, Abstract; |
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6. |
Curcumin and Curcuma longa L. extract ameliorate lipid accumulation through the regulation of the endoplasmic reticulum redox and ER stress: H.Y. Lee, et al.; Sci. Rep. 7, 6513 (2017), Application(s): PDI assay of tissue lysates, Abstract; Full Text |
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7. |
Nox4 regulates the eNOS uncoupling process in aging endothelial cells: H.Y. Lee, et al.; Free Radic. Biol. Med. 113, 26 (2017), Application(s): PDI assay of HUVEC cell lysates, Abstract; |
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8. |
PDI regulates seizure activity via NMDA receptor redox in rats: J.Y. Kim, et al.; Sci. Rep. 7, 42491 (2017), Application(s): Hippocampal tissue lysates, Abstract; Full Text |
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9. |
Protein disulfide isomerase regulates renal AT1 receptor function and blood pressure in rats: X. Wang, et al.; Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 313, F461 (2017), Application(s): Renal tissue lysates, Abstract; Full Text |
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10. |
Requirement of zinc transporter SLC39A7/ZIP7 for dermal development to fine-tune endoplasmic reticulum function by regulating protein disulfide isomerase: B.H. Bin, et al.; J. Invest. Dermatol. 137, 1682 (2017), Application(s): ER fractions from murine osteoblasts, Abstract; |
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11. |
Succination of protein disulfide isomerase links mitochondrial stress and endoplasmic reticulum stress in the adipocyte during diabetes: A.M. Manuel, et al.; Antioxid. Redox Signal. 27, 1281 (2017), Application(s): 3T3-L1 adipocytes and adipose tissue lysates, Abstract; Full Text |
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12. |
Adverse outcomes associated with cigarette smoke radicals related to damage to protein disulfide isomerase: H. Kenche, et al.; J. Biol. Chem. 291, 4763 (2016), Abstract; |
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13. |
Adverse Outcomes Associated with Cigarette Smoke Radicals Related to Damage to Protein-disulfide Isomerase: H. Kenche, et al.; J. Biol. Chem. 291, 4763 (2016), Application(s): in-vitro assay with recombinant PDI, Abstract; Full Text |
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14. |
Role of two sequence motifs of mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor in its survival-promoting activity: K. Mätlik, et al.; Cell Death Dis. 6, e2032 (2015), Abstract; Full Text |
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15. |
Methods of measuring protein disulfide isomerase activity: a critical overview: M.M. Watanabe, et al.; Front. Chem. 2, 73 (2014), Application(s): Review on available assays to measure PDI activity, Abstract; Full Text |
|
16. |
N-octanoyl dopamine treatment of endothelial cells induces the unfolded protein response and results in hypometabolism and tolerance to hypothermia: E. Stamellou, et al.; PLoS One 9, e99298 (2014), Abstract; Full Text |
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17. |
The protein disulfide isomerases PDIA4 and PDIA6 mediate resistance to cisplatin-induced cell death in lung adenocarcinoma: G. Tufo, et al.; Cell Death Differ. 21, 685 (2014), Application(s): Evaluation of PDI activity in whole extracts and ER fractions, Abstract; |
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18. |
Rapid activation of monocyte tissue factor by antithymocyte globulin is dependent on complement and protein disulfide isomerase: F. Langer, et al.; Blood 121, 2324 (2013), Abstract; |
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19. |
Oxidative processing of latent Fas in the endoplasmic reticulum controls the strength of apoptosis: V. Anathy, et al.; Mol. Cell. Biol. 32, 3464 (2012), Abstract; |
◆一般参考文献
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1. |
Attachment and entry of Chlamydia have distinct requirements for host protein disulfide isomerase: S. Abromaitis & R.S. Stephens; PLoS Pathog. 5, e1000357 (2009), Abstract; |
|
2. |
Protein disulfide isomerase (PDI) associates with NADPH oxidase and is required for phagocytosis of Leishmania chagasi promastigotes by macrophages: C. X. Santos, et al.; J. Leukoc. Biol. 86, 989 (2009), Abstract; |
|
3. |
The proteostasis boundary in misfolding diseases of membrane traffic: D.M. Hutt, et al.; FEBS Lett. 583, 2639 (2009), Abstract; |
|
4. |
Increasing melanoma cell death using inhibitors of protein disulfide isomerases to abrogate survival responses to endoplasmic reticulum stress: P.E. Lovat, et al.; Cancer Res. 68, 5363 (2008), Abstract; |
|
5. |
Targeting homeostatic mechanisms of endoplasmic reticulum stress to increase susceptibility of cancer cells to fenretinide-induced apoptosis: the role of stress proteins ERdj5 and ERp57: M. Corazzari, et al.; Br. J. Cancer 96, 1062 (2007), Abstract; |
|
6. |
Coupling endoplasmic reticulum stress to the cell death program: R.V. Rao, et al.; Cell Death Differ. 11, 372 (2004), Abstract; |
|
7. |
Protein-disulfide isomerase-mediated reduction of two disulfide bonds of HIV envelope glycoprotein 120 occurs post-CXCR4 binding and is required for fusion: R. Barbouche, et al.; J. Biol. Chem. 278, 3131 (2003), Abstract; |
|
8. |
Protein disulfide isomerase, a component of the estrogen receptor complex, is associated with Chlamydia trachomatis serovar E attached to human endometrial epithelial cells: C.H. Davis, et al.; Infect. Immun. 70, 3413 (2002), Abstract; |
|
9. |
Protein-disulfide isomerase-mediated reduction of the A subunit of cholera toxin in a human intestinal cell line: P.A. Orlandi; J. Biol. Chem. 272, 4591 (1997), Abstract; |
|
10. |
Acceleration of reactivation of reduced bovine pancreatic ribonuclease by a microsomal system from rat liver: R.F. Goldberger, et al.; J. Biol. Chem. 238, 628 (1963), Abstract; |
| 产品编号 | 产品名称 | 产品规格 | 产品等级 | 备注 |
| ENZ-51024-KP002 | PROTEOSTAT PDI assay kit PROTEOSTAT PDI检测试剂盒 |
2×96 tests | ||
| ENZ-51024-KP050 | PROTEOSTAT PDI assay kit PROTEOSTAT PDI检测试剂盒 |
50 tests |
PROTEOSTAT® 蛋白聚集检测 PROTEOSTAT® Protein aggregation assay
PROTEOSTAT® 蛋白聚集检测
PROTEOSTAT® Protein aggregation assay
- 产品特性
- 相关资料
- Q&A
- 参考文献
PROTEOSTAT® 蛋白聚集检测
某些肽链在经过错误折叠后很容易形成聚集，在生物技术和制药领域，这些聚集会严重影响蛋白的生产和应用。许多以蛋白多肽为基础研发的药物具有极大的应用前景，可是蛋白因错误折叠而导致构象发生变化形成聚集，使蛋白失活，最终影响药物疗效，造成不可估计的损失。污染物导致的蛋白聚集包括宿主细胞蛋白、非蛋白微粒和蛋白的损伤形式。
基于此 Enzo Life Sciences 推出了新产品 PROTEOSTAT® Protein Aggregation Assay，内含红色荧光信号染料，可特异性结合聚集蛋白，进行检测。具有广泛的检测范围，可有效检测可见和不可见的蛋白微粒。
◆原理
蛋白聚集严重影响以蛋白为基础研发的药物。在药物制剂中，蛋白聚集在生物活性和免疫原性方面影响药效。
蛋白聚集发生在生产过程的各个阶段包括细胞培养、纯化、生产、储存、运输等方面。制药工业希望在生物工艺中找到新的方法，可用于检测、追踪、定量分析影响蛋白聚集的因素。
近年来以冻干稳定形式存在的蛋白聚集体作为标准品，可以准确地定量检测蛋白聚集，加上新颖的只需在酶标仪里即可实验的 PROTEOSTAT® protein aggregation assay，可对蛋白检测方法进行优化。
在这篇文章中，使用已知浓度的聚集 IgG 标准品作为标准曲线，通过 PROTEOSTAT® protein aggregation assay/standards 对 IgG 的聚集水平进行检测，集中分析了制药工业中常见的３种聚集形式。
● 热诱导聚集
● 机械诱导聚集
● 冷冻和反复冻融诱导聚集
◆优点・特色
● 高通量筛选方法用于流式细胞仪平台监测蛋白稳定性
● 在荧光微孔板中即可进行简单、灵敏、均一地检测
● 不需分离目的蛋白或稀释样品
● 与传统蛋白聚集检测染料相比更灵敏，信号更明亮
● 优化的缓冲液和辅料用于蛋白制剂研发
● 检测灵敏度可低至亚微摩尔级别，含量在１%-５%的聚集蛋白也能被检测出
● 在广泛的 PH（4-10）和离子强度范围都可使用，提供至少两个数量级的线性动态范围
● 使用 PROTEOSTAT® 蛋白聚集检测标准品可对溶液中的聚集蛋白精确定量
● 可检测蛋白多肽聚集程度，可用于筛选蛋白聚集激活剂或抑制剂
在蛋白聚集实验研究中，将 PROTEOSTAT® protein aggregation assay 和 Synergy Mx Multi-Mode Microplate reader 联用，可适合用于监测由温度、机械损伤和反复冻融所引起的蛋白聚集。
稳定的蛋白颗粒作为标准品可快速建立标准曲线，加快定量分析蛋白聚集响应。这个检测方法能够可靠地检测到浓缩抗体制剂中小于 0.2% 的聚集蛋白，线性动态范围为２个数量级。
PROTEOSTAT® protein aggregation assay 和 PROTEOSTAT® protein aggregation standards 检测蛋白聚集特点在于操作简单，能够检测低水平的蛋白聚集情况，只需 30 分钟，就能够得到完整的分析结果。
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案例一
不同搅拌速率对蛋白聚集的影响 |
案例二
蛋氨酸被氧化后可抑制蛋白聚集 |
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使用本产品检测后，可知搅拌速度越快，蛋白聚集程度越大。 |
蓝色曲线为对照，没有搅拌速度在 300 rpm 下，绿色曲线与红色曲线分别表示蛋氨酸被氧化后的蛋白聚集情况与天然蛋白的聚集情况。使用本产品检测后，可知蛋氨酸被氧化后可抑制蛋白聚集。 |
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使用流式细胞仪结合PROTEOSTAT® 蛋白聚集分析试剂盒使用例 |
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A PROTEOSTAT® 蛋白聚集分析试剂盒检测 IgG 聚集标准品 B PROTEOSTAT® 蛋白聚集分析试剂盒检测硅油滴 C PROTEOSTAT® 蛋白聚集分析试剂盒检测 IgG 聚集标准品和硅油滴的混合物。 使用流式细胞仪结合 PROTEOSTAT® 蛋白聚集分析试剂盒检测 IgG 聚集标准品，可与其他非蛋白微粒如油滴区别开来，且无须考虑样品微粒大小（经检测 >97% 的 IgG 聚集标准品都小于２μm）。 |
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案例・应用
材料和方法
Enzo Life Sciences 推出了 PROTEOSTAT® protein aggregation assay 和 PROTEOSTAT® protein aggregation standards，利用荧光分子信号染料可特异性结合聚集蛋白和多肽，在微孔板中即可检测。
探针在溶液中是不发出荧光的，当与聚集蛋白的四级结构结合时会发出明亮的荧光。一旦聚集标准品发生重组，它们将含有０-12.5% 的聚集蛋白，总蛋白浓度维持在１mg/mL。
通过粒子分析成像鉴定标准品发现90%的蛋白聚集体长度为２-10 μm，约9%的蛋白聚集体长度为 10-20 μm，约 0.7% 的蛋白聚集体为长度大于 20 μm。
Synergy™ Mx Multi-Mode Microplate Reader（BioTek Instruments）可用于所有蛋白聚集分析。它的激发波长为 500 nm，发射波长为 600 nm，激发和发射狭缝宽度为 9 nm，便于检测 PROTEOSTAT® 染料。Thioflavin T 染料可以在激发单色器激发波长为 435 nm，发射波长为 495 nm，都在激发和发射狭缝宽度为 9 nm 的条件下进行检测。
结果
在 96 孔微板中检测比较 PROTEOSTAT® 和 Thioflavin T 染料与蛋白聚集的结合能力。纯化的兔抗羊 lgG（4.26 mg/mL）在 pH 2.7 的盐酸水溶液中，80℃ 温度下孵育 90 分钟后会形成蛋白聚集体。
聚集信号由聚合体和单体混合比例不同决定的，但总的 lgG 蛋白浓度仍然是 60 μg/mL。在 50 mM 磷酸钾，pH 7，3 μM ProteoStat 检测试剂或 5 μM Thioflavin T 染料中读数。这些浓度在以前做过预实验，已经确定是最优的浓度。
在蛋白和染料一起孵育 15 分钟后使用 BioTek Synergy Mx Microplate Reader 读数。所用的板为 Greiner µClear® black，clear bottom 96-well microplates (Greiner Bio One)。
在相同情况下，PROTEOSTAT® 染料的荧光强度比 Thioflavin T 染料高 100 倍。对于浓度为 1.2 μg/mL的聚集体，ProteoStat 染料的信噪比为 12.8，而 Thioflavin T 染料的信噪比仅为 1.2，表明 PROTEOSTAT® 染料在蛋白聚集检测中更准确、灵敏度更高。
正因为由此显著的优势，PROTEOSTAT® protein aggregation assay 和 ProteoStat protein aggregation standards 通常能够共同用于各种常规形式的蛋白聚集检测。
监控热诱导聚集
当蛋白受到提高温度刺激会加速其聚集。羊 lgG（4 mg/mL）在各个时期都处于搅拌速度 400 rmp，100 mM 磷酸钠，pH 7.2，温度 60℃ 下。
在每个时间点，25 μL lgG 用于测量。首先样本在 1× assay buffer 中稀释４倍后，得到的蛋白最终浓度为 1 mg/mL 。在每个孔中加入 98 μL 的检测蛋白和 2 μL 的 PROTEOSTAT® Detection Reagent Loading Solution，每个时间点都做平行孔。
同时，PROTEOSTAT® protein aggregation standards 中含有稳定的、高质量的对照样本，用来做标准曲线。
如图１所示，使用 PROTEOSTAT® 染料检测羊 lgG 在热诱导下的聚集情况，生成的曲线表明不同阶段 lgG 蛋白聚集的情况。
在刚开始阶段蛋白聚集情况较少，接着观察到生长阶段聚集体开始形成，最后生长率降低直至变成０，表明蛋白单体已几乎消失，差不多完全形成聚集体。
图1：热诱导羊 IgG 蛋白聚集
监控机械诱导聚集
虽然普遍认为机械搅拌会加速蛋白聚集形成，但目前机械外力造成蛋白聚集形成的原理还不是十分明确。在药物研发中，可能受到抽真空或者过滤等产生的机械外力使蛋白药物形成聚集。
羊抗鼠 lgG（10 mg/mL）溶解在含有 10 mM 的磷酸钠，150 mM Nacl，0.05% 叠氮化钠，pH 7.2 的溶液中。机械搅拌的实验条件如下：室温、4 mL 的平底褐色玻璃瓶中加入 200 μL lgG 溶液，使用 Variomag® Poly electronic stirrer（2Mag-USA），以 990 rpm 速度进行搅拌。搅拌棒体积为1.0×0.4×0.2 cm3。
在每个时间点，取10 μL lgG 用于检测。样品在 1×assay buffer 中稀释 10 倍后，得到的蛋白最终浓度为 1 mg/mL。在每个孔中加入 98 μL 的检测蛋白和 2 μL 的 PROTEOSTAT® Detection Reagent Loading Solution，每个时间点都做平行孔。
用 PROTEOSTAT® protein aggregation standards 作为标准曲线，定量检测机械搅拌诱导产生的蛋白聚集。在上述实验条件下，蛋白聚集与时间成正比例关系（图２）。
图2：机械诱导样抗鼠 IgG 蛋白聚集
监控冷冻和反复冻融诱导聚集
冷冻对于蛋白稳定是至关重要的，因为在冷冻过程中会导致溶液的浓度发生变化。羊抗鼠 lgG（10 mg/mL）溶解在 10mM 的磷酸钠，150 mM Nacl，0.05% 叠氮化钠，pH 7.2 的溶液中。样品保存在 -20℃，反复冻融数次。
在每个时间点，取10 μL lgG 用于检测。样品在 1×assay buffer 中稀释 10 倍后，得到的蛋白最终浓度为 1 mg/mL。在每个孔中加入 98 μL 的检测蛋白和 2 μL 的 PROTEOSTAT® Detection Reagent Loading Solution，每个时间点做平行孔。
用 PROTEOSTAT® protein aggregation standards 作标准曲线，定量检测反复冻融诱导产生的蛋白聚集体。实验表明反复冻融也会诱导产生蛋白聚集。与热诱导引起蛋白聚集一样，会观察到一条Ｓ型曲线图。
| 产品编号 | 产品名称 | 产品规格 | 产品等级 | 备注 |
| ENZ-51023-KP050 | PROTEOSTAT® Protein aggregation assay PROTEOSTAT ® 蛋白聚集检测 |
50 tests | – | – |
| ENZ-51023-KP002 | PROTEOSTAT® Protein aggregation assay | 2×96 tests | – | – |
PROTEOSTAT® Thermal shift stability assay kit 加速蛋白稳定性筛选
PROTEOSTAT® Thermal shift stability assay kit
加速蛋白稳定性筛选
- 产品特性
- 相关资料
- Q&A
- 参考文献
PROTEOSTAT® Thermal shift stability assay kit
加速蛋白稳定性筛选
● 简单、灵敏、均相的荧光检测，无需分离或稀释样品
● 可用于加速优化蛋白稳定性条件
● 无需了解蛋白功能或配体结合位点，也可进行配体结合检测
● 可在较广的温度、pH值和离子强度范围内使用，与常用的缓冲液和辅料兼容
● 为采用多种仪器进行交叉验证提供一种方便、互补的正交方法
PROTEOSTAT® Thermal shift 稳定性检测试剂盒内含有一种检测蛋白聚集的荧光染料，因此可用于监测系统热应力条件下的蛋白稳定性。通过 Thermal shift 分析，可轻松确定大部分蛋白的聚集温度。聚集温度是蛋白稳定性的指标，可用于优化使蛋白聚集最小化的条件，以及鉴定与目标蛋白结合并赋予结构稳定性的配体。配合使用相关的 PROTEOSTAT® 蛋白复性和聚集敏感试剂盒（产品编号：ENZ-51040）可确定合适的蛋白复性条件。增加聚集温度的优化条件可使蛋白的稳定性有所提升。
图1. 利用PROTEOSTAT® Thermal shift 稳定性检测试剂盒分析山羊抗小鼠 IgG（pH=7.4，11.2 mg/mL）的典型结果。
图1. 使用 RT-PCR 仪器，以 3°C/min 的速率将温度从30°C升至99°C，同时连续读取荧光值。蓝线表示原始荧光强度数据，红线表示对应的一阶导
图1. 数曲线，代表荧光强度曲线的斜率。通过一阶导数图，可得出蛋白的聚集温度（Tagg：斜率最大点）。
PROTEOSTAT® 染料的 Tagg 值不同于 SYPRO® Orange 染料的 Tm 值
图2. PROTEOSTAT® 染料所得得聚集温度不同于使用 SYPRO® Orange 染料获得的熔解温度。
图2. SYPRO® Orange 染料是一种环境敏感染料，能够与未折叠蛋白的疏水区结合，用于测量 Tm。Tm 是 Thermal shift 曲线的温度中点，在温度
图2. 中点 Tm 时，样品中的目标蛋白一半呈现出解折叠状态，而另一半保持折叠状态。解折叠不依赖于相邻蛋白。PROTEOSTAT 是一种分子转子染
图2. 料，可与蛋白质聚集体的表面结合。Tagg 是热聚集曲线的中点。蛋白解折叠后开始聚集，聚集取决于相邻蛋白。蛋白浓度越高，聚集的趋势越
图2. 大。
◆产品详情
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特点 |
本试剂盒用于监测系统热应力条件下的蛋白稳定性。 |
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品质保证 |
每批次 PROTEOSTAT®Thermal shift 稳定性检测试剂盒的样品试剂盒均已按照操作手册中的步骤进行测试。 16 μg/ml β-乳球蛋白的聚集温度单峰位于76°±2°C处。 |
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使用/稳定性 |
在产品标签注明的日期前，试剂盒组分在适当的储存条件下可稳定保存。 |
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可存放于-20°C的无霜冰箱中。 |
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储存条件 |
避光。避免反复冻融。 |
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运输方式 |
干冰运输 |
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储存温度 |
-20°C |
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组分 |
· PROTEOSTAT® TS 检测试剂 · β-乳球蛋白对照 · 10X 检测缓冲液 |
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技术信息/产品说明 |
应用说明： Prediction of Aggregation Propensity and Monitoring of Aggregation of Antibody-Drug Conjugates (ADC) using ProteoStat® Reagents 检测样本： PROTEOSTAT® Cited Samples
Enzo及PROTEOSTAT均为Enzo Life Sciences, Inc. 的商标。Grenier为Grenier Bio-One 的注册商标。Enzo的部分产品和产品应用受美国、外国专利以及正在申请的专利的保护。本产品由ENZO LIFE SCIENCES, INC. 制造和销售，仅供研究市场的终端用户作研究使用，不得用于诊断或治疗用途。购买行为不包括在商业上使用、开发或以其他方式利用本产品的任何权利或许可。未经ENZO LIFE SCIENCES, INC. 事先明确书面授权，严禁对本产品进行任何商业用途、开发或利用，或使用本产品进行研发。 |
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监管状态 |
RUO – 仅供研究使用 |
◆产品列表
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产品编号 |
产品名称 |
包装 |
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ENZ-51027-K400 |
PROTEOSTAT® Thermal shift stability assay kit |
400 tests |
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ENZ-51027-K100 |
100 tests |
产品参考文献
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