Phos-tag™ 实验设计


Phos-tag™ 实验设计


Phos-tag™ 实验设计


◆  研究领域

  

     磷酸化蛋白和磷酸化多肽的研究


◆  Phos-tag 的简介


  Phos-tag(Phosphate-binding tag)是由日本广岛大学的Kinoshita等研制的磷酸化蛋白蛋白捕获分子。Phos-tag 螯合Zn2+或者Mn2+重金属离子后形成一个半封闭的空间。在pH值6~8的中性条件下,该空间恰好能容纳一个磷酸基团,使得螯合有金属离子的Phos-tag 分子能够与磷酸基团牢固而稳定的结合。可以特异性结合所有氨基酸的磷酸化基团,广泛运用于细菌,酵母,昆虫等物种研究。

 

◆  Phos-tag 系列产品


  利用螯合有金属离子的Phos-tag 可以特异性结合磷酸化基团的特点,研发了Phos-tag 系列产品,运用于常见的蛋白实验,比如SDS-PAGE,免疫印迹,亲和层析,质谱等。

 

Phos-tag 系列产品

产品描述

用途

具体运用实验

Phos-tag Acrylamide

Phos-tag 与丙烯酰胺(Acrylamide,SDS-PAGE分离胶主要成分)结合

分离磷酸化和非磷酸化蛋白。SDS-PAGE分离胶制备中添加金属离子(Zn2+或者Mn2+)和Phos-tag Acrylamide。在蛋白电泳过程中,磷酸化基团与金属离子螯合的Phos-tag Acrylamide发生特异性结合,导致磷酸化蛋白的迁移速度变慢。

SDS-PAGE(单一蛋白)

免疫印迹(多种蛋白混合液,例如细胞裂解液,组织均浆液,体外激酶反应体系。使用目的蛋白的非磷酸化抗体作为一抗)

Phos-tag Biotin

Phos-tag 与生物素(Biotin)结合

可与亲和素标记的HRP结合,检测磷酸化蛋白。

免疫印迹(正常SDS-PAGE)

Phos-tag  Agarose

Phos-tag 与琼脂糖(Agarose)结合

利用磷酸化基团与金属离子螯合的Phos-tag Agarose特异性结合,纯化磷酸化蛋白。

亲和层析法

Phos-tag Mass Analytical kit

Phos-tag 与不同荷质比的Zn结合

检测微量磷酸化蛋白和磷酸化多肽。

质谱实验

 

备注:除Phos-tag Mass Analytical kit之外,其他Phos-tag 系列产品都需要配置金属离子溶液。

◆具体实例


1. 体外激酶反应,激酶和底物都带有标签,反应后亲和层析法纯化获得激酶和底物,如何检测底物的磷酸化情况?

  如果底物和激酶分子量差别大,通过正常的SDS-PAGE能够区分,建议使用Phos-tag Biotin。将激酶和底物进行免疫印迹实验,用Phos-tag Biotin作为抗体检测底物的磷酸化基团(需记录底物的条带位置)。可通过剥离(strip)方式剥离Phos-tag Biotin,用底物的非磷酸化抗体进一步验证其位置。

  如果底物和激酶分子量差别不大,可进行Mn2+-Phos-tag SDS-PAGE实验,然后转膜,用底物的非磷酸化抗体检测(没有使用激酶的抗体,所以检测不到激酶的带)。在Mn2+-Phos-tag SDS-PAGE中磷酸化和非磷酸化底物发生分离,用底物的非磷酸化抗体可以检测所有底物。免疫印迹实验后,观察所有的条带,非磷酸化底物由于没有和Mn2+-Phos-tag Acrylamide结合,所以迁移速度较快,磷酸化底物则迁移速度变慢。通过迁移率的变化,分析磷酸化底物的含量。

 

备注:

1) Mn2+-Phos-tag SDS-PAGE实验中,建议使用α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated(038-23221),该产品中含有磷酸化

       和非磷酸化的α-Casein,确保试剂和实验条件能够分离磷酸化蛋白。

2)如果没有非磷酸化底物,可使用Alkaline Phosphatase(for Biochemistry)(018-10693)对底物进行去磷酸化反应。

 

2. 如何检测EGF(表皮生长因子)刺激后细胞内MAPK的磷酸化水平?

   收集EGF刺激的细胞,制备细胞裂解液作为样品。进行正常的SDS-PAGE实验和Mn2+-Phos-tag SDS-PAGE实验,转膜后用MAPK的非磷酸化抗体作为一抗进行检测(检测所有的MAPK,包括磷酸化和非磷酸化)。正常SDS-PAGE实验中,磷酸化的MAPK和非磷酸化MAPK没有分离,而在Mn2+-Phos-tag SDS-PAGE实验中磷酸化MAPK和非磷酸胡MAPK发生分离,所以转膜后,用MAPK抗体检测,可以看到分离的条带。比较正常的SDS-PAGE用MAPK抗体的免疫印迹实验和Mn2+-Phos-tag SDS-PAGE用MAOK抗体的免疫印迹实验,多出来的条带就是磷酸化的MAPK。

 

备注:该实验的前提是EGF刺激后细胞内的MAPK发生磷酸化,细胞内包含磷酸化和非磷酸化的MAPK。如果刺激后细胞内不含有磷酸化的MAPK,

          则无法用Phos-tag Acrylamide分离磷酸化和非磷酸化MAPK。

 

 

3. 研究蛋白相互作用的实验中,构建带有不同标签的2种融合蛋白,共转染细胞,在细胞内发生磷酸化反应。通过不同标签的亲和层析柱获得纯化的

    蛋白,是否可用Phos-tag Agarose纯化,进行后续免疫共沉淀实验(Co-IP)实验?

   Phos-tag Agarose纯化磷酸化蛋白,采用高盐的洗脱方式,没有使用界面活性剂、还原剂、酸或者碱洗脱,蛋白不发生变性,可进行后续的Co-IP实验。

 

 

4. 检测的样品中含有两种磷酸化的蛋白,分子量很接近,如何使用Phos-tag 产品检测磷酸化?

   如果样品中两种磷酸化蛋白的分子量很接近,通过正常的SDS-PAGE实验无法区分,建议使用Phos-tag Acrylamide。进行Mn2+-Phos-tag SDS-PAGE实验后用两种蛋白的非磷酸化抗体进行检测。

  也可以使用Phos-tag Biotin。进行正常SDS-PAGE实验后,先用两种蛋白的非磷酸化抗体进行检测,剥离(strip)后用Phos-tag Biotin。如果磷酸化蛋白量少的话,剥离(strip)会去除一些蛋白,可能会影响检测的效果。

 

 

5. 使用Phos-tag Mass Analytical kit,样品中如果含有磷酸缓冲液是否有影响?

   该试剂盒检测磷酸化蛋白和多肽的灵敏度较高,样品中含有的磷酸缓冲液会影响磷酸化蛋白与Phos-tag 结合。

 

 

       Phos-tag 系列产品: http://www.boppard.cn/product/listshow/66.html
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